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emmaya

新虫 (初入文坛)

[求助] RED重组敲除基因,PCR验证时既有目的基因条带也有打靶片段条带 已有4人参与

如题,欲敲除的是大肠杆菌K-12的C600分子伴侣GroEL基因,大小约为1700bp。用RED重组方法,电转入两边各带50bp同源臂的线性片段(大小约1100bp)后,对筛选出来的疑似敲除菌株抽基因组PCR验证。

引物为目的基因5’、3’端,扩增出来的条带有两条,既有没敲掉的原基因大小,也有线性片段的条带。

在目的基因上游和线性片段中间设计的一对引物,则只有一条带,且大小正确,理论上来讲线性片段应该交换到基因组上了;

对目的基因非同源臂部分,设计了一对引物,疑似敲除的菌株与原始菌扩增出来的条带大小一样,说明目的基因还在。

想请教,这个情况到底是为什么呢,怎么会两种情况同时出现,不是应该要么线性片段交换上要么没有吗?

不知道问题出在哪里,有没有大牛有相似的经历的,什么办法可以解决呢?求给点意见!
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浅语8905

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

两边各带50bp同源臂的线性片段pcR的模板线性的吗?如果不是线性会造成很多假阳性。但也可能是错配造成的
9楼2015-01-30 12:26:00
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
99%的可能性是染菌了
相信自己
2楼2014-03-27 12:38:10
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emmaya

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2014-03-27 12:38:10
99%的可能性是染菌了

起初也怀疑是染菌了,我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落,然后用同样的抗性摇菌,抽的基因组进行PCR的,这样还有可能是因为染菌吗?
3楼2014-03-27 16:02:06
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l68266152

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by emmaya at 2014-03-27 16:02:06
起初也怀疑是染菌了,我是用50ug/ml氯霉素筛选出来的单菌落,然后用同样的抗性摇菌,抽的基因组进行PCR的,这样还有可能是因为染菌吗?...

仔细看了下,有可能是单交换,可以在目的基因“下游”和线性片段中间设计的一对引物,测试。
相信自己
5楼2014-03-31 12:46:18
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