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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] 昆虫基因PCR后电泳条带淡,急求帮助????

我在做几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段,目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段,50μl的扩增反应体系是:
Premix Ex Taq   25μl
引物1(LCO1490)(10μM)2μl
引物2 (HCO2198)(10μM)2μl
模板1μl(<50ng)1~4μ不等,浓度在150~300ng/ul。
加水至50ul。
   PCR反应程序:95度10min。94℃预变性3min,94℃变性60s,44℃退火60s,72℃延伸60s,共35个循环,循环结束后,72℃延伸10min。
图中显示有的条带太暗了而且有的有弥散,引物正常。做过退火温度的梯度实验,有出来的条带但很淡。今晚做的条带更淡且有弥散。请问我该怎么调?
另外昨天做实验时水加少了,结果有的种类出来了,请问是预混酶浓度变化的问题吗?不知道哪位高人能帮帮分析一下?

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hpzhao1980

新虫 (初入文坛)

你比我强,我做了一天发现没有跑出一个条带!!!!!
2楼2013-03-18 21:02:12
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1989zb

金虫 (小有名气)

一样啊 我一直做 一直都是条带暗 各种条件变了都一样
3楼2013-03-18 21:48:59
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gastropoda

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

个人建意加大Taq酶的量试一下.
4楼2013-04-11 14:09:44
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1279341226

新虫 (初入文坛)

我现在正在做寄生蜂的这个该片段,用的同样的引物,不知道是不是虫子太小,而且用的是无损伤提取方法,连很淡的条带都没有,请问前辈做的是哪几种虫子呀,求助哇。。。
5楼2015-04-06 21:07:15
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