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大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
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最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下： 目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了 |
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14楼2012-02-19 19:50:49
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32楼2012-02-22 12:21:09
34楼2012-02-22 15:29:22
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酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100%Eth,去上清，晾干即可。 酒精最好都是预冷的 |
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mirror389540楼2012-02-25 11:05:55
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| PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！如果没有PCR片段没有A，那么可以通过一步加A的步骤，然后再连接 |
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30楼2012-02-22 08:57:01
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如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我试过这样的体系，没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端，连T载体应该是很好连的，PCR扩增后，最好把产物纯化下，酒精沉淀或胶回收都可以。 |
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sxp10316楼
2012-02-19 15:29
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江南的竹7楼
2012-02-19 15:37
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2012-02-19 15:46
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kanghuijun10楼
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echo123418楼
2012-02-20 15:43
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