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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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若水5886

新虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:43:42
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的,载体选择的是对的(平端和粘性末端的选择),感受态是好的,还有连接的温度低了,我用的全式金5分钟快速克隆产品,25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物比例为1:4左右,是体积比还是浓度比?PCR产物浓度太低的话也会影响连接效率的
32楼2012-02-22 12:21:09
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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