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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了
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1楼2012-02-19 11:00:57
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若水5886

新虫 (小有名气)
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小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:43:42
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物比例为1:4左右，是体积比还是浓度比？PCR产物浓度太低的话也会影响连接效率的
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32楼2012-02-22 12:21:09
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若水5886

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
35楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:07:48:
载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的

首先你的产物没有纯化，我不知道你P出来的产物里有没有非特异性的产物；另外不知道你PCR产物和载体的浓度比例，如果你产物浓度很低的话阳性克隆会少得；最后在漫长的4度连接过程中有部分载体自连咯，阳性率也就低啦。既然你目的只是测序看看，那你只要挑到阳性克隆，验证一下，送去测序不就行了。阳性克隆多也只是那个序列呀
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38楼2012-02-24 14:23:12
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