[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

37楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:11:05:
请教一下， 你说的对PCR产物进行纯化，酒精沉淀，是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗？

楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-02-19 15:19:04:
4度过夜完全可以。感觉你的连接比例，不是太优，你不妨试一下1:2或1:3的比例连接.

楼: Originally posted by plus19 at 2012-02-21 08:35:23:
你用什么酶做的PCR？
最好用普通的Taq酶啊！希望实验成功

楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49:
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂 ...

楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-20 10:24:03:
16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基 ...

楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-02-20 17:40:34:
PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！如果没有PCR片段没有A，那么可以通过一步加A的步骤，然后再连接

29楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-22 08:55:21:
载体+片段=1+4，这个比例很高啊，没试过这样的体系，现在还在怀疑是不是PCR产物出问题了

楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09:
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物 ...

楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09:
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物 ...

楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-22 09:00:01:
如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我试过这样的体系，没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端，连T载体应该是很好连的，PCR扩增后，最好把产物纯化下，酒精沉淀或胶回收都可以。

35楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:07:48:
载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的

楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-25 11:05:55:
酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100 ...

楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-25 11:05:55:
酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100 ...

42楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-28 10:19:28:
PCR产物里一般不会有什么杂质，这样沉淀最重要的是起到什么作用啊？浓缩？

33楼: Originally posted by hustxiong at 2012-02-22 13:34:38
如果很急  可以买点感受态来试试
我曾经遇到过这个问题，也可以找点别人成功的质粒来验证你的感受态效率。
如果经费允许，可以用 Takara 的感受态，效果还不错
一只（100ul）可以做5个样。  我一直这么做的。

...

14楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒 ...

17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-20 10:24:03
16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基因 ...