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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了
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1楼 2012-02-19 11:00:57
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hustxiong

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:43:29
如果很急  可以买点感受态来试试
我曾经遇到过这个问题，也可以找点别人成功的质粒来验证你的感受态效率。
如果经费允许，可以用 Takara 的感受态，效果还不错
一只（100ul）可以做5个样。  我一直这么做的。

还有注意  你培养箱的温度。我出现过，显示37度，实测42度，当然长不出。
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33楼2012-02-22 13:34:38
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liucong046

木虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！ok
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14楼2012-02-19 19:50:49
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-20 13:37:21
16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基因有问题了，一般来说，连T载体会长很多菌斑。载体+基因＝1+4或0.5+4.5。这是我们平常用的，都没有什么区别，连T载体，我感觉加不加IPTG/Xgal都行，因为连接效率很高，基本上都是阳性的。
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17楼2012-02-20 10:24:03
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watercity

金虫 (小有名气)
连接要过夜么？我们怎么经常连接1小时（1000bp以下的）、或者2小时（1000bp以上的）？是按照试剂使用说明书上操作的。我1000bp的克隆成功了2个。1小时。你怎么过夜啊？过夜是不是大概要10小时左右了啊？？？？
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19楼2012-02-20 16:41:56
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c3024034

银虫 (正式写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
我会建议好你加大PCR产物的量，可以1：7
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20楼2012-02-20 16:50:59
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shicaozhu

银虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
T载不太可能会自连，会不会是你的PCR出了问题，有没有考虑过加阳性对照？
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22楼2012-02-20 18:54:56
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若水5886

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
小丹木木(金币+2): 鼓励交流 2012-02-22 13:43:42
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物比例为1:4左右，是体积比还是浓度比？PCR产物浓度太低的话也会影响连接效率的
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32楼2012-02-22 12:21:09
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liujianmin68

木虫 (职业作家)
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2012-02-22 18:42:06
首先，进行T-A连接，4度或16度均可，不过TAKARA的试剂盒里说明用16度，因此，用这个载体最好还是16度连接比较好。Promega公司的T载体4度连接效率还是很高的。
第二，载体和片段之间有一定的比例是应该的，x-gal和IPTG可以不加，你选择1：4不是太大问题，其实用1：2即可。
之所以出现你现在这种情况，你要确认：1、你的pcr产物是不是用高保真酶扩增的？2、你的引物是不是跟载体上某些序列能非特异性结合？3、转化子可以抽提质粒，酶切后电泳验证。
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34楼2012-02-22 15:29:22
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
37楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:11:05:
请教一下， 你说的对PCR产物进行纯化，酒精沉淀，是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗？

酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100%Eth,去上清，晾干即可。

酒精最好都是预冷的
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mirror3895
40楼2012-02-25 11:05:55
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普通回帖

Petter_JDW

木虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
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2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题，换一批试试。
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3楼2012-02-19 13:11:37
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故，用16度连接过夜，4度连接时间要更长的。
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4楼2012-02-19 15:14:36
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bonbonzd

木虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
4度过夜完全可以。感觉你的连接比例，不是太优，你不妨试一下1:2或1:3的比例连接.
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5楼2012-02-19 15:19:04
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userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜，祝福好运哦~~~~~~~~~~~~~~~`
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8楼2012-02-19 15:40:24
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by bonbonzd at 2012-02-19 15:19:04:
4度过夜完全可以。感觉你的连接比例，不是太优，你不妨试一下1:2或1:3的比例连接.

谢谢指点，我试试
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11楼2012-02-19 17:50:25
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我叫路人甲

银虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-20 08:06:24
你看载体的说明说，是在什么温度下多长时间连的。
我们用promega的载体4°，过夜连的，效果也还不错。
目的片段也是1.5k
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12楼2012-02-19 18:16:18
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
你说阳性菌落太少，是不是有不少载体自连的质粒被转化进宿主菌啊，回查一下载体处理是不是有问题
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13楼2012-02-19 19:46:58
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接有问题
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15楼2012-02-20 09:44:22
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jingzhang08

新虫 (初入文坛)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
4度太低了，16度过夜吧
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16楼2012-02-20 10:20:53
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！如果没有PCR片段没有A，那么可以通过一步加A的步骤，然后再连接
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mirror3895
21楼2012-02-20 17:40:34
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我爱沈泉

金虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
继续加油 肯定会有结果的
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23楼2012-02-20 20:09:44
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panda73

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你用的是什么DNA聚合酶进行PCR，只有Taq类（不带矫正功能的酶）才能克隆到T载体中
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24楼2012-02-20 22:48:02
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plus19

木虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你用什么酶做的PCR？
最好用普通的Taq酶啊！希望实验成功
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mirror3895
25楼2012-02-21 08:35:23
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chitty6361

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
一般都是16度过夜连接啊！怎么会用4度呢？
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26楼2012-02-21 14:32:20
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by plus19 at 2012-02-21 08:35:23:
你用什么酶做的PCR？
最好用普通的Taq酶啊！希望实验成功

我就是用的很普通的Taq酶，还想换好点的试试呢，可就是连接效率很低啊
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27楼2012-02-22 08:49:24
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49:
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂 ...

好的，谢谢，我再试试
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28楼2012-02-22 08:53:05
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-20 10:24:03:
16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基 ...

载体+片段=1+4，这个比例很高啊，没试过这样的体系，现在还在怀疑是不是PCR产物出问题了
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29楼2012-02-22 08:55:21
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by zhang8826857 at 2012-02-20 17:40:34:
PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！如果没有PCR片段没有A，那么可以通过一步加A的步骤，然后再连接

谢谢，我用的是普通Taq酶，应该都有加A功能
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30楼2012-02-22 08:57:01
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
29楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-22 08:55:21:
载体+片段=1+4，这个比例很高啊，没试过这样的体系，现在还在怀疑是不是PCR产物出问题了

如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我试过这样的体系，没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端，连T载体应该是很好连的，PCR扩增后，最好把产物纯化下，酒精沉淀或胶回收都可以。
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mirror3895
31楼2012-02-22 09:00:01
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09:
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物 ...

载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的
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35楼2012-02-24 14:07:48
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09:
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物 ...

载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的
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36楼2012-02-24 14:08:04
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-22 09:00:01:
如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我试过这样的体系，没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端，连T载体应该是很好连的，PCR扩增后，最好把产物纯化下，酒精沉淀或胶回收都可以。

请教一下， 你说的对PCR产物进行纯化，酒精沉淀，是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗？
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37楼2012-02-24 14:11:05
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若水5886

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
35楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:07:48:
载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的

首先你的产物没有纯化，我不知道你P出来的产物里有没有非特异性的产物；另外不知道你PCR产物和载体的浓度比例，如果你产物浓度很低的话阳性克隆会少得；最后在漫长的4度连接过程中有部分载体自连咯，阳性率也就低啦。既然你目的只是测序看看，那你只要挑到阳性克隆，验证一下，送去测序不就行了。阳性克隆多也只是那个序列呀
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38楼2012-02-24 14:23:12
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angie8610

铁虫 (小有名气)
★
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16度连接过夜。。。。。
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39楼2012-02-24 14:50:00
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-25 11:05:55:
酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100 ...

谢谢
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41楼2012-02-28 10:18:25
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-25 11:05:55:
酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100 ...

PCR产物里一般不会有什么杂质，这样沉淀最重要的是起到什么作用啊？浓缩？
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42楼2012-02-28 10:19:28
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
16度过夜连接效率会更高些，如果连接效率没问题，很可能是感受态的问题，建议换个更纯的菌种重新做感受态
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43楼2012-02-28 10:22:41
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
42楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-28 10:19:28:
PCR产物里一般不会有什么杂质，这样沉淀最重要的是起到什么作用啊？浓缩？

会有一些剩余的酶，buffer里的其它离子，以及未用完的dNTP等等
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44楼2012-03-01 13:36:33
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zx1984

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你的酶切怎么样？从头重新做一遍
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45楼2012-03-01 14:44:54
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yixinyuan

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
4度过夜没有什么问题，应该是连接效率的问题。
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46楼2012-03-01 20:47:29
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厦大生物杨超

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
一 amp的浓度会不会过高嘿 （0.1mg/ml）。
二 16度 链接16个小时嘿
三 还是不要省事的做下 或许有好的结果
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47楼2012-03-01 22:37:21
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生物生物

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
33楼: Originally posted by hustxiong at 2012-02-22 13:34:38
如果很急  可以买点感受态来试试
我曾经遇到过这个问题，也可以找点别人成功的质粒来验证你的感受态效率。
如果经费允许，可以用 Takara 的感受态，效果还不错
一只（100ul）可以做5个样。  我一直这么做的。

...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp，我用的是 Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看l
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48楼2013-03-28 07:29:06
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生物生物

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看l
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49楼2013-03-28 07:31:45
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-20 10:24:03
16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基因 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看
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50楼2013-03-28 07:32:23
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sxp10316楼
2012-02-19 15:29   回复  
mirror3895(金币+1):谢谢参与
祝福祝福
江南的竹7楼
2012-02-19 15:37   回复  
mirror3895(金币+1):谢谢参与
jiangxl.06189楼
2012-02-19 15:46   回复  
mirror3895(金币+1):谢谢参与
kanghuijun10楼
2012-02-19 15:47   回复  
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echo123418楼
2012-02-20 15:43   回复  
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