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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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生物生物

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
17楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-20 10:24:03
16度和4度连接,我们都试过,对于连T载体来说,都差不多,T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多,如果不多,可能就是转化效率不高,需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多,那可能就是你的目的基因 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题,只是我目的条带263bp(Taq酶),我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T: 1ul片段:4ul,Takara 的感受态,都是100ul做两只样,涂板(只用30ul菌液)培养后菌很多啊,但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选,后来加了X-ga,IPTG,但根本看不到蓝白班现象,挑菌pcr也无果。请你说说看
50楼2013-03-28 07:32:23
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查看全部 56 个回答

Petter_JDW

木虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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