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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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小猫三两只

金虫 (正式写手)

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★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
小丹木木(金币+2): 鼓励积极交流哦 2012-02-20 13:37:21

16度和4度连接，我们都试过，对于连T载体来说，都差不多，T载体应该很好连的。你对照长的菌斑多不多，如果不多，可能就是转化效率不高，需要重新制感受态细胞。如果是你的连接产物长的不多，那可能就是你的目的基因有问题了，一般来说，连T载体会长很多菌斑。载体+基因＝1+4或0.5+4.5。这是我们平常用的，都没有什么区别，连T载体，我感觉加不加IPTG/Xgal都行，因为连接效率很高，基本上都是阳性的。