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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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引用回帖:

楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09:
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物 ...

载体：PCR是体积比，我只是做目的片段的测序，很简单的一件事情，所以没有对产物进行纯化，用的Taq酶也是可以在末端加A的，产物可直接用于TA克隆的