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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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若水5886

新虫 (小有名气)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
35楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:07:48:
载体:PCR是体积比,我只是做目的片段的测序,很简单的一件事情,所以没有对产物进行纯化,用的Taq酶也是可以在末端加A的,产物可直接用于TA克隆的

首先你的产物没有纯化,我不知道你P出来的产物里有没有非特异性的产物;另外不知道你PCR产物和载体的浓度比例,如果你产物浓度很低的话阳性克隆会少得;最后在漫长的4度连接过程中有部分载体自连咯,阳性率也就低啦。既然你目的只是测序看看,那你只要挑到阳性克隆,验证一下,送去测序不就行了。阳性克隆多也只是那个序列呀
38楼2012-02-24 14:23:12
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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