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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了
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1楼 2012-02-19 11:00:57
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liucong046

木虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；  有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒纯化！ok
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14楼2012-02-19 19:50:49
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
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2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题，换一批试试。
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3楼2012-02-19 13:11:37
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故，用16度连接过夜，4度连接时间要更长的。
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4楼2012-02-19 15:14:36
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