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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼 2012-02-19 11:00:57

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引用回帖:

楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-22 09:00:01:
如果PCR量很低，可以用1+4的比例，我试过这样的体系，没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端，连T载体应该是很好连的，PCR扩增后，最好把产物纯化下，酒精沉淀或胶回收都可以。

请教一下，你说的对PCR产物进行纯化，酒精沉淀，是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗？