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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


送鲜花一朵
引用回帖:
: Originally posted by 小猫三两只 at 2012-02-22 09:00:01:
如果PCR量很低,可以用1+4的比例,我试过这样的体系,没有问题的。不过一般0.5+4.5就行了。只要PCR产物不是平末端,连T载体应该是很好连的,PCR扩增后,最好把产物纯化下,酒精沉淀或胶回收都可以。

请教一下, 你说的对PCR产物进行纯化,酒精沉淀,是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗?
37楼2012-02-24 14:11:05
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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