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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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小猫三两只

金虫 (正式写手)

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引用回帖:

37楼: Originally posted by mirror3895 at 2012-02-24 14:11:05:
请教一下，你说的对PCR产物进行纯化，酒精沉淀，是直接向PCR产物里加2V无水乙醇然后离心吗？

酒精沉淀：产物（一般为100ul，不足的话加水补充）+1/10体积醋酸钠（3M，PH＝5.2）+2.5体积100%酒精。－80度沉淀30分钟，（－20度也行，时间稍长些）；12000rpm,10min;去上清，75% Eth,12000,10min；去上清，100%Eth,去上清，晾干即可。

酒精最好都是预冷的