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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点
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生物生物

新虫 (初入文坛)
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32楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物比 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看
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51楼2013-03-28 07:32:43
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生物生物

新虫 (初入文坛)
★
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做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。载体说明书上说16度半小时就可以连接上了，师兄说连接过夜试一下，都没有结果。
而且载体，感受态都是TaKara的，新买的。我是一个菜鸟，不知道说的够不够详细，请大家帮我分析分析是什么原因。拜谢。
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52楼2013-03-28 12:27:51
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cyp1512

金虫 (初入文坛)
★
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加一个参照一起转化看一下是连接转化效率低还是感受态问题，一般来说连接转化就是相对质粒转化少，但是没有也不应该
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53楼2013-03-28 15:09:35
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my_father

铁虫 (初入文坛)
★
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补点ATP试试 10mM的 加1μl就可以了
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54楼2013-03-28 17:37:25
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hustxiong

木虫 (正式写手)
★
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52楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 12:27:51
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分 ...

能够在AMP平板上长出许多菌落，说明转化时没有问题的，只是空载而已，那就是问题出现在连接上。
1）你的PCR产物 是不是经过割胶回收纯化后  再连接的？如果是，确信你回收回来没有，要检测的，微量紫外或者跑胶都可以
  建议：用TAE胶回收，效果会好于TBE
2）现在takara  有个专卖 solution 的试剂盒，里面有个solution III，据说可以显著提高连接效率。载体我们都是稀释10倍用的，配这个试剂盒，会节省很多成本哦。
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55楼2013-03-29 16:14:20
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liucong046

木虫 (小有名气)
★
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49楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 07:31:45
你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了 ...

我觉得你还是把你的酶和载体换一套再试试，这个一般情况下很好做的，再不然就是你买的感受态有问题？我建议你还是自己花点时间自己制备点感受态。祝顺利！
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56楼2013-03-30 09:46:02
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