24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 24 (小学生)
金币: 5173.8
帖子: 860
在线: 258.6小时
虫号: 621408

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有162人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2012-02-19 11:00:57

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

生物生物

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 14
帖子: 16
在线: 2.9小时
虫号: 2380645

引用回帖:

32楼: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-22 12:21:09
首先你要确定你的PCR产物是新鲜的，载体选择的是对的（平端和粘性末端的选择），感受态是好的，还有连接的温度低了，我用的全式金5分钟快速克隆产品，25-37度这样连接十分钟左右就可以的。还有你说的载体和PCR产物比 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看