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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 24 (小学生)
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虫号: 621408

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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hustxiong

木虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 62816

★
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引用回帖:

52楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 12:27:51
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分 ...

能够在AMP平板上长出许多菌落，说明转化时没有问题的，只是空载而已，那就是问题出现在连接上。
1）你的PCR产物是不是经过割胶回收纯化后  再连接的？如果是，确信你回收回来没有，要检测的，微量紫外或者跑胶都可以
  建议：用TAE胶回收，效果会好于TBE
2）现在takara  有个专卖 solution 的试剂盒，里面有个solution III，据说可以显著提高连接效率。载体我们都是稀释10倍用的，配这个试剂盒，会节省很多成本哦。