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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 24 (小学生)
金币: 5173.8
帖子: 860
在线: 258.6小时
虫号: 621408

[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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liucong046

木虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 3801.9
帖子: 85
在线: 79.9小时
虫号: 1223121

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

49楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-28 07:31:45
你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了 ...

我觉得你还是把你的酶和载体换一套再试试，这个一般情况下很好做的，再不然就是你买的感受态有问题？我建议你还是自己花点时间自己制备点感受态。祝顺利！