[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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生物生物

新虫 (初入文坛)

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。1ul载体，4ulpcr产物，5ul自带的solutionI混合，16度连接过夜，42度热激45秒，冰上2分钟导入感受态DH5a摇床培养1小时后，在含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。载体说明书上说16度半小时就可以连接上了，师兄说连接过夜试一下，都没有结果。
而且载体，感受态都是TaKara的，新买的。我是一个菜鸟，不知道说的够不够详细，请大家帮我分析分析是什么原因。拜谢。