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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 24 (小学生)
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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼 2012-02-19 11:00:57

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生物生物

新虫 (初入文坛)

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★
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引用回帖:

33楼: Originally posted by hustxiong at 2012-02-22 13:34:38
如果很急可以买点感受态来试试
我曾经遇到过这个问题，也可以找点别人成功的质粒来验证你的感受态效率。
如果经费允许，可以用 Takara 的感受态，效果还不错
一只（100ul）可以做5个样。我一直这么做的。

...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp，我用的是 Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看l