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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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watercity

金虫 (小有名气)

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连接要过夜么？我们怎么经常连接1小时（1000bp以下的）、或者2小时（1000bp以上的）？是按照试剂使用说明书上操作的。我1000bp的克隆成功了2个。1小时。你怎么过夜啊？过夜是不是大概要10小时左右了啊？？？？

赞一下(1人)

19楼2012-02-20 16:41:56

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