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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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生物生物

新虫 (初入文坛)


★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49
你好,我们经常用的体系是:
solution : 5ul
pmd-18/19T: 0.5ul
片段:4.5ul
16度连接过夜,37度过夜培养;  有90%的阳性率!你可以试试,祝你好运
另外:PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶,并要用纯化试剂盒 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题,只是我目的条带263bp(Taq酶),我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T: 1ul片段:4ul,Takara 的感受态,都是100ul做两只样,涂板(只用30ul菌液)培养后菌很多啊,但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选,后来加了X-ga,IPTG,但根本看不到蓝白班现象,挑菌pcr也无果。请你说说看l
49楼2013-03-28 07:31:45
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查看全部 56 个回答

Petter_JDW

木虫 (小有名气)


★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)


★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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★
mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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