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铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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生物生物

新虫 (初入文坛)

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★
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引用回帖:

14楼: Originally posted by liucong046 at 2012-02-19 19:50:49
你好，我们经常用的体系是：
solution : 5ul
pmd-18/19T： 0.5ul
片段：4.5ul
16度连接过夜，37度过夜培养；有90%的阳性率！你可以试试，祝你好运
另外：PCR产物一定要是用还有A尾的Taq酶，并要用纯化试剂盒 ...

你好我遇到了和楼主相似的问题，只是我目的条带263bp（Taq酶），我用的是PMD-18。 solution : 5ulpmd-18/19T： 1ul片段：4ul，Takara 的感受态，都是100ul做两只样，涂板（只用30ul菌液）培养后菌很多啊，但是挑了十来个菌落做pcr鉴定都没有目的条带。开始只做的Amp筛选，后来加了X-ga，IPTG，但根本看不到蓝白班现象，挑菌pcr也无果。请你说说看l