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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体，请高手指点

最近做克隆测序，非常不顺利，很苦恼。简单描述一下：
目的片段1.5kb，使用的是TAKARA pMD19-T载体，载体和PCR产物比例为1:4左右，4度连接过夜，转化DH5a感受态细胞，以control片段做对照，42度热击，复壮后涂amp板子，培养14小时候，平板上有菌落长出来（解释一下：为了省事，没有加x-gal和IPTG），但是在做菌落PCR验证时，阳性克隆很少很少，是怎么回事啊？求各位高手指点一下，谢谢了

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1楼2012-02-19 11:00:57

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liujianmin68

木虫 (职业作家)

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西瓜(金币+2): 鼓励应助 2012-02-22 18:42:06

首先，进行T-A连接，4度或16度均可，不过TAKARA的试剂盒里说明用16度，因此，用这个载体最好还是16度连接比较好。Promega公司的T载体4度连接效率还是很高的。
第二，载体和片段之间有一定的比例是应该的，x-gal和IPTG可以不加，你选择1：4不是太大问题，其实用1：2即可。
之所以出现你现在这种情况，你要确认：1、你的pcr产物是不是用高保真酶扩增的？2、你的引物是不是跟载体上某些序列能非特异性结合？3、转化子可以抽提质粒，酶切后电泳验证。