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mirror3895

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 大肠杆菌感受态转化子总是空载体,请高手指点

最近做克隆测序,非常不顺利,很苦恼。简单描述一下:
目的片段1.5kb,使用的是TAKARA pMD19-T载体,载体和PCR产物比例为1:4左右,4度连接过夜,转化DH5a感受态细胞,以control片段做对照,42度热击,复壮后涂amp板子,培养14小时候,平板上有菌落长出来(解释一下:为了省事,没有加x-gal和IPTG),但是在做菌落PCR验证时,阳性克隆很少很少,是怎么回事啊?求各位高手指点一下,谢谢了
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liujianmin68

木虫 (职业作家)


西瓜(金币+2): 鼓励应助 2012-02-22 18:42:06
首先,进行T-A连接,4度或16度均可,不过TAKARA的试剂盒里说明用16度,因此,用这个载体最好还是16度连接比较好。Promega公司的T载体4度连接效率还是很高的。
第二,载体和片段之间有一定的比例是应该的,x-gal和IPTG可以不加,你选择1:4不是太大问题,其实用1:2即可。
之所以出现你现在这种情况,你要确认:1、你的pcr产物是不是用高保真酶扩增的?2、你的引物是不是跟载体上某些序列能非特异性结合?3、转化子可以抽提质粒,酶切后电泳验证。
34楼2012-02-22 15:29:22
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜~~~~~4度咋么行
2楼2012-02-19 12:39:53
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dappxiaomm

金虫 (小有名气)



mirror3895(金币+1):谢谢参与
16度连接过夜啊。。。。。还有可能就是你制备的感受态有问题,换一批试试。
3楼2012-02-19 13:11:37
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mirror3895(金币+1):谢谢参与
连接效率太差的缘故,用16度连接过夜,4度连接时间要更长的。
4楼2012-02-19 15:14:36
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