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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的条带pcr之后，片段很暗
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panyax

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的条带pcr之后，片段很暗 已有1人参与

模板用的是别人构建好的表达载体，是滴在滤纸上溶出来的。经过pcr条带之后的目的条带很暗。而且用PCR产物做模板，进行2次PCR的时候，连目的片段都扩不出来了。求分析下原因。
             原来用这个模板p过，一模一样的东西， 原来的条带很亮，只是原来用的是taq酶，片段长了，保真性不好。现在用高保真和taq进行pcr都是要么p不出来，要么片段很暗。
                片段大小在4kb左右，暗的那4条是最近P的，maker用的是1k plus，亮的那2条带是上个月初p的，maker用的是15k maker。
     


                   求分析下原因啊，急求！！！

目的条带pcr之后，片段很暗
Administrator 2016-06-15 19 时 19 分.jpg


目的条带pcr之后，片段很暗-1
Administrator 2016-05-13 12 时 59 分.jpg
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1楼 2016-06-16 16:08:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 支持积极回帖 2016-06-17 06:57:39
panyax: 金币+1, ★有帮助 2016-06-27 10:53:55
panyax: 金币+1, ★有帮助 2016-06-27 10:55:04
会不会是模板浓度不太好，可以将滤纸上的质粒融出来后做一次转化，以后需要模板直接摇菌提质粒，这样质粒的浓度及纯度应该比较好的，并且质粒作为模板，扩增还是相对比较容易的，如果引物没问题的话。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
4楼2016-06-16 22:26:50
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Isaac Li

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-06-17 09:55:00
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普通回帖

panyax

新虫 (初入文坛)
不能沉啊
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2楼2016-06-16 17:55:50
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jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)
估计是引物降解了，重新溶新引物试试吧。

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3楼2016-06-16 19:22:30
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选择远方523

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 谢谢积极回帖 2016-06-17 06:57:53
可能是你的程序有点问题，高保真酶扩增比较慢，需要延长延伸的时间。

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5楼2016-06-17 00:07:32
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-06-16 22:26:50
会不会是模板浓度不太好，可以将滤纸上的质粒融出来后做一次转化，以后需要模板直接摇菌提质粒，这样质粒的浓度及纯度应该比较好的，并且质粒作为模板，扩增还是相对比较容易的，如果引物没问题的话。
...

这个模板放了比较久，浓度还可以，但是转化板子都不长菌。。。常规转化和电转化我都试过
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6楼2016-06-17 08:10:37
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 选择远方523 at 2016-06-17 00:07:32
可能是你的程序有点问题，高保真酶扩增比较慢，需要延长延伸的时间。

我是按酶的说明书来设的程序，延伸时间15s/K，应该不是这个问题吧，因为我开始用这个条件做过PCR，P出来的就是第二张图的那个亮度
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7楼2016-06-17 08:12:52
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiuzi59 at 2016-06-16 19:22:30
估计是引物降解了，重新溶新引物试试吧。

我也觉得可能是引物的问题。
亮带是我第一次PCR的时候做的，那个引物因为没有加酶切位点，后来重新合了一次引物。
            加了酶切位点，重新合成引物之后，就没有p亮过了
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8楼2016-06-17 08:17:23
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Isaac Li at 2016-06-17 09:55:00
以PCR产物为模板进行二次扩增，PCR产物不能产时间存放，最好当天用，4K的大片段时间长也是会裂解的，高保真Taq酶一般都够用，你可以适当改变下退火温度，我还以你的模板有问题，你可以将PCR模板和二次PCR产物同时跑 ...

我那天是晚上11点左右PCR结束的， 第二天早上八点多进行的pcr。。。应该吗诶那么快裂解啊。。。。开始PCR得到的片段测序之后，没有完整的阅读框
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10楼2016-06-18 12:32:00
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