| 查看: 2125 | 回复: 1 | |||
[求助]
PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。 已有1人参与
|
|
质粒模板长度大约5.7kb，使用的酶是Takara公司的PrimerStarHS高保真酶，引物Tm值计算出来是59℃。 反应体系是： 反应程序是： 2XPrimerStar GC Buffer（Mg2+) 12.5ul 预变性 98℃ 2min dNTP Mixture 2ul 变性 98℃ 10s 引物1 0.5ul 退火 Tm±5℃ 15s 引物2 0.5ul 延伸 72℃ 6min 质粒模板 0.5ul 延伸 72℃ 10min PrimerStarHS酶 0.25ul 第2到第4步总共进行30个循环 dd水 8.75ul 体系总体积 25ul 琼脂糖凝胶的浓度是0.8%，电泳条件：电压120V，电流120am,30min。 我曾经用57℃的退火温度扩增成功过，如图1： 但是之后再使用相同的体系和条件就P不出来了，于是我又做了温度梯度PCR，情况如下： 50——58℃ 每个样品温度间隔1℃ 图2： 59——63℃ 每个样品温度间隔大约1℃ 图3 还按照说明书尝试过两部法，98℃ 10s 68℃ 6min 效果如下：图4 还做过其他一些尝试，有P出来一点的，也有完全P不出来的，他们的共同特点就是点样孔都很亮。 我的模板是用试剂盒提的应该不会有蛋白残余；也把模板稀释过十倍再上样，可加样孔还是会发亮，而条代就完全没有了；也曾经尝试过只加酶不加引物，就什么东西也没有，发亮的东西应该也不是酶。 现在不知道该如何下手，恳请各位大虾支招，万分感谢！  图1.jpg  图2.jpg  图3.jpg  图4.jpg |
回复此楼» 本帖附件资源列表
-
欢迎监督和反馈：小木虫仅提供交流平台，不对该内容负责。
本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 20150707_A_C_反向PCR定点突变.bmp
- 附件 2 : 20150712_PrimerStar酶_A氨基酸温度梯度反向PCR定点突变.bmp
- 附件 3 : 20150714_PrimerStar酶_A氨基酸温度梯度反向PCR定点突变.bmp
- 附件 4 : 20150717_155位C_D_E_F氨基酸两步法反向PCR定点突变.bmp
2015-07-24 17:42:58, 1.25 M
2015-07-24 18:05:44, 1.25 M
2015-07-24 18:07:46, 1.25 M
2015-07-24 18:17:28, 1.25 M
» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物 |
» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有61人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
2楼2015-07-24 21:13:45