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诺森德的雪

新虫 (初入文坛)

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[求助] PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。已有1人参与

质粒模板长度大约5.7kb，使用的酶是Takara公司的PrimerStarHS高保真酶，引物Tm值计算出来是59℃。
反应体系是：                                                          反应程序是：
2XPrimerStar GC Buffer（Mg2+)    12.5ul                   预变性  98℃          2min
dNTP Mixture                               2ul                      变性    98℃          10s
引物1                                           0.5ul                   退火    Tm±5℃    15s
引物2                                           0.5ul                   延伸    72℃          6min
质粒模板                                     0.5ul                   延伸    72℃          10min
PrimerStarHS酶                            0.25ul                   第2到第4步总共进行30个循环
dd水                                           8.75ul
体系总体积                                  25ul

琼脂糖凝胶的浓度是0.8%，电泳条件：电压120V，电流120am,30min。

我曾经用57℃的退火温度扩增成功过，如图1：

但是之后再使用相同的体系和条件就P不出来了，于是我又做了温度梯度PCR，情况如下：
50——58℃ 每个样品温度间隔1℃ 图2：

59——63℃ 每个样品温度间隔大约1℃ 图3

还按照说明书尝试过两部法，98℃ 10s 68℃ 6min 效果如下：图4

还做过其他一些尝试，有P出来一点的，也有完全P不出来的，他们的共同特点就是点样孔都很亮。
我的模板是用试剂盒提的应该不会有蛋白残余；也把模板稀释过十倍再上样，可加样孔还是会发亮，而条代就完全没有了；也曾经尝试过只加酶不加引物，就什么东西也没有，发亮的东西应该也不是酶。
现在不知道该如何下手，恳请各位大虾支招，万分感谢！

图1.jpg

PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。-1

图2.jpg

PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。-2

图3.jpg

PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。-3

图4.jpg

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附件 1 : 20150707_A_C_反向PCR定点突变.bmp

2015-07-24 17:42:58, 1.25 M

附件 2 : 20150712_PrimerStar酶_A氨基酸温度梯度反向PCR定点突变.bmp

2015-07-24 18:05:44, 1.25 M

附件 3 : 20150714_PrimerStar酶_A氨基酸温度梯度反向PCR定点突变.bmp

2015-07-24 18:07:46, 1.25 M

附件 4 : 20150717_155位C_D_E_F氨基酸两步法反向PCR定点突变.bmp

2015-07-24 18:17:28, 1.25 M

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1楼 2015-07-24 18:20:20

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momo1943

银虫 (初入文坛)

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专业: 细胞信号转导

【答案】应助回帖

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1. kit ???? OD260/280? ?????~1.8 OD260/230?? ????????2.0~2.4
2. ????????plasmid loading ???, plasmid ????????, ????????PCR????,
~25ng????
3. plasmid 5.7kb (????lmarker ??10Kb??) , ??0.8%???z, ??????well???????
genomic DNA~

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