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PrimerStarHS酶反向PCR做质粒的定点突变，目的条带很淡，点样孔却很亮，求大虾支招。 已有1人参与
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质粒模板长度大约5.7kb，使用的酶是Takara公司的PrimerStarHS高保真酶，引物Tm值计算出来是59℃。 反应体系是： 反应程序是： 2XPrimerStar GC Buffer（Mg2+) 12.5ul 预变性 98℃ 2min dNTP Mixture 2ul 变性 98℃ 10s 引物1 0.5ul 退火 Tm±5℃ 15s 引物2 0.5ul 延伸 72℃ 6min 质粒模板 0.5ul 延伸 72℃ 10min PrimerStarHS酶 0.25ul 第2到第4步总共进行30个循环 dd水 8.75ul 体系总体积 25ul 琼脂糖凝胶的浓度是0.8%，电泳条件：电压120V，电流120am,30min。 我曾经用57℃的退火温度扩增成功过，如图1： 但是之后再使用相同的体系和条件就P不出来了，于是我又做了温度梯度PCR，情况如下： 50——58℃ 每个样品温度间隔1℃ 图2： 59——63℃ 每个样品温度间隔大约1℃ 图3 还按照说明书尝试过两部法，98℃ 10s 68℃ 6min 效果如下：图4 还做过其他一些尝试，有P出来一点的，也有完全P不出来的，他们的共同特点就是点样孔都很亮。 我的模板是用试剂盒提的应该不会有蛋白残余；也把模板稀释过十倍再上样，可加样孔还是会发亮，而条代就完全没有了；也曾经尝试过只加酶不加引物，就什么东西也没有，发亮的东西应该也不是酶。 现在不知道该如何下手，恳请各位大虾支招，万分感谢！  图1.jpg  图2.jpg  图3.jpg  图4.jpg |
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- 附件 2 : 20150712_PrimerStar酶_A氨基酸温度梯度反向PCR定点突变.bmp
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- 附件 4 : 20150717_155位C_D_E_F氨基酸两步法反向PCR定点突变.bmp
2015-07-24 17:42:58, 1.25 M
2015-07-24 18:05:44, 1.25 M
2015-07-24 18:07:46, 1.25 M
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2楼2015-07-24 21:13:45
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