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卡西西VS鸣人金虫 (小有名气)
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[求助]
连接载体转化后挑单菌落，菌落pcr扩出条带，但是摇菌摇不起来 已有3人参与
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载体是连接有EGFP的瞬时表达载体，有氨苄抗性。转化到DH5α中，涂含氨苄的平板。倒置培养12个小时候未见菌落，但是17个小时候有菌落，且密度不是很大，单菌落数不多不少的样子。我先是挑单菌落摇菌，准备做菌液pcr，但是37°C转速200培养过夜之后LB培养基仍然是清亮的，没有任何菌生长。再挑单菌落，换了别人配的LB震荡培养，仍然是没有摇起来。最后我挑单菌落加到20μl的水中做菌落pcr，设置了空白对照，pcr结果显示空白对照没有条带，其它菌落pcr只有两个未扩出条带。将pcr条带最亮的几管分别加到4mlLB培养基中，再加入4μl氨苄，37°C振荡培养过夜。最后居然还是没有菌落生长，培养基一片清亮······ 我在网上查到说，挑单菌落的时候可能挑到平板上未干的连接液，连接液里可能含有未连接到载体上的目的片段，所以pcr可以扩出条带。但是我很确定我挑到了菌落，肉眼看到菌落慢慢的分散开来然后水变浑浊。即使是空载，摇菌应该也能摇起来。平板是刚刚倒的，氨苄的作用肯定存在。氨苄也没问题，别人刚用过我直接拿过来用的，别人的结果没出问题。 以前挑过很多次菌，菌液pcr也做过，，都没有发生这种状况。我觉得我的操作没有问题，但是实在是找不到原因了，哪位高手给指点一下啊…… 昨天刚刚又转化了一次，现在已经有14个小时了，肉眼只能看到几个小菌落。一般来说12个小时应该就长得差不多了。转化涂板用的是新配制的氨苄板，菌落生长缓慢会不会是感受态细菌的问题呢？细菌没有接受外源抗性质粒的活性了，但还是能缓慢的在含氨苄的平板上生长，在含有氨苄的LB液体培养基里培养24个小时也不会快速的生长。是不是这样呢？ |
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