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panyax

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的条带pcr之后,片段很暗 已有1人参与

模板用的是别人构建好的表达载体,是滴在滤纸上溶出来的。经过pcr条带之后的目的条带很暗。而且用PCR产物做模板,进行2次PCR的时候,连目的片段都扩不出来了。求分析下原因。
             原来用这个模板p过,一模一样的东西, 原来的条带很亮,只是原来用的是taq酶,片段长了,保真性不好。现在用高保真和taq进行pcr都是要么p不出来,要么片段很暗。
                片段大小在4kb左右,暗的那4条是最近P的,maker用的是1k plus,亮的那2条带是上个月初p的,maker用的是15k maker。
     


                   求分析下原因啊,急求!!!

目的条带pcr之后,片段很暗
Administrator 2016-06-15 19 时 19 分.jpg


目的条带pcr之后,片段很暗-1
Administrator 2016-05-13 12 时 59 分.jpg
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panyax

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jiuzi59 at 2016-06-16 19:22:30
估计是引物降解了,重新溶新引物试试吧。

我也觉得可能是引物的问题。
亮带是我第一次PCR的时候做的,那个引物因为没有加酶切位点,后来重新合了一次引物。
            加了酶切位点,重新合成引物之后,就没有p亮过了
8楼2016-06-17 08:17:23
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查看全部 13 个回答

jiuzi59

铁杆木虫 (正式写手)

估计是引物降解了,重新溶新引物试试吧。

发自小木虫Android客户端
3楼2016-06-16 19:22:30
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 支持积极回帖 2016-06-17 06:57:39
panyax: 金币+1, 有帮助 2016-06-27 10:53:55
panyax: 金币+1, 有帮助 2016-06-27 10:55:04
会不会是模板浓度不太好,可以将滤纸上的质粒融出来后做一次转化,以后需要模板直接摇菌提质粒,这样质粒的浓度及纯度应该比较好的,并且质粒作为模板,扩增还是相对比较容易的,如果引物没问题的话。

发自小木虫Android客户端
天空才是极限,我有信心飞的更高!
4楼2016-06-16 22:26:50
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选择远方523

新虫 (初入文坛)


xn8008: 金币+1, 谢谢积极回帖 2016-06-17 06:57:53
可能是你的程序有点问题,高保真酶扩增比较慢,需要延长延伸的时间。

发自小木虫IOS客户端
5楼2016-06-17 00:07:32
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