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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点.
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wolf308

新虫 (初入文坛)

[求助] 用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点. 已有4人参与

各高手前辈，请教电泳分析的问题，我提取了总RNA，反转录之后，针对一个基因，设计了两对引物，退回温度设在了50度，35个循环，电泳图如附件。
    Marker左侧是引物1，扩增的片段为100左右，也在Marker的附近，说明大小合适，但是目的条带上面有拖尾现象，是不是非特异性扩增啊？
    Marker右侧是引物2，引物设计时的片段大小也在300bp左右，也能和Marker对应上，说明片段大小正确。问题是这两对引物是同时扩增的，亮度都不高，会是什么原因呢？如果去测序的话，会有好的结果吗？
    我自己认为引物2比引物1要好一点，对吗？

用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点.
PCR.jpg.jpg.jpg.jpg
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1楼 2014-11-23 00:01:15
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
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wolf308(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 13:21:05
右侧引物2测序应该是好点。但是有点暗！不过没事！
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wolf308
人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-11-23 10:28:24
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wolf308

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-11-23 10:28:24
右侧引物2测序应该是好点。但是有点暗！不过没事！

暗的原因可能有哪些啊？会是模板量不够吗？

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3楼2014-11-23 13:14:40
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zhaokexue

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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wolf308(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:09:06
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3楼: Originally posted by wolf308 at 2014-11-23 13:14:40
暗的原因可能有哪些啊？会是模板量不够吗？
...

你这个已经很好了，完全可以去测序，分子量小，嵌入的EB少，显色自然要暗一些，还有就是和点样量有关，电泳时多上点样亮度也会增加

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wolf308
4楼2014-11-23 13:44:35
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wolf308

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by zhaokexue at 2014-11-23 13:44:35
你这个已经很好了，完全可以去测序，分子量小，嵌入的EB少，显色自然要暗一些，还有就是和点样量有关，电泳时多上点样亮度也会增加
...

多谢你们的指点，我只有这么多金币，感谢你们！

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5楼2014-11-23 13:55:20
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wolf308

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-11-23 10:28:24
右侧引物2测序应该是好点。但是有点暗！不过没事！

多谢了，金币奉上！我拿PCR产物去测序呢还是要回收胶里面的条带，我个人认为，这个结果，特异性还可以，是不是可以直接拿PCR产物去测序啊？

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6楼2014-11-23 13:58:48
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zhaokexue

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wolf308(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:09:17
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6楼: Originally posted by wolf308 at 2014-11-23 13:58:48
多谢了，金币奉上！我拿PCR产物去测序呢还是要回收胶里面的条带，我个人认为，这个结果，特异性还可以，是不是可以直接拿PCR产物去测序啊？
...

你可以扣胶，用纯化试剂盒把目标片段送给测序公司，我都是这么做的，好处是纯化后目标产物不容易降解。如果你说的那样，不知道你经常用的公司是不是可以接收凝胶样品。最好纯化后再去测序…

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7楼2014-11-23 14:41:17
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wolf308

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by zhaokexue at 2014-11-23 14:41:17
你可以扣胶，用纯化试剂盒把目标片段送给测序公司，我都是这么做的，好处是纯化后目标产物不容易降解。如果你说的那样，不知道你经常用的公司是不是可以接收凝胶样品。最好纯化后再去测序…
...

我的PCR产物还有大约15ul, 在PCR管子里面，这个可以送去测序吧？跑电泳的胶已经给扔掉了�😓😓😓，，
，😁

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8楼2014-11-23 21:51:39
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zhaokexue

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8楼: Originally posted by wolf308 at 2014-11-23 21:51:39
我的PCR产物还有大约15ul, 在PCR管子里面，这个可以送去测序吧？跑电泳的胶已经给扔掉了�😓😓😓，，
，😁
...

最好把剩下的跑个电泳，扣胶纯化后再测样，直接用转录产物好像也可以，我都是纯化后，你问下测序公司的业务员他们接收什么样的样品

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9楼2014-11-24 00:07:39
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nrcy1987

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:09:25
建议在每次做PCR时都设置一个negative control，比如不加模板只加水。如果negative control完全没有带，即使sample的带很弱，也很可信。我由于前一段时间没设negative control，出了很大的问题。只是以防万一，很有必要的。
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10楼2014-11-24 15:32:16
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