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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点.
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wolf308

新虫 (初入文坛)

[求助] 用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点. 已有4人参与

各高手前辈，请教电泳分析的问题，我提取了总RNA，反转录之后，针对一个基因，设计了两对引物，退回温度设在了50度，35个循环，电泳图如附件。
    Marker左侧是引物1，扩增的片段为100左右，也在Marker的附近，说明大小合适，但是目的条带上面有拖尾现象，是不是非特异性扩增啊？
    Marker右侧是引物2，引物设计时的片段大小也在300bp左右，也能和Marker对应上，说明片段大小正确。问题是这两对引物是同时扩增的，亮度都不高，会是什么原因呢？如果去测序的话，会有好的结果吗？
    我自己认为引物2比引物1要好一点，对吗？

用cDNA做PCR之后的电泳图，求指点.
PCR.jpg.jpg.jpg.jpg
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1楼 2014-11-23 00:01:15
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nrcy1987

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:09:25
建议在每次做PCR时都设置一个negative control，比如不加模板只加水。如果negative control完全没有带，即使sample的带很弱，也很可信。我由于前一段时间没设negative control，出了很大的问题。只是以防万一，很有必要的。
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10楼2014-11-24 15:32:16
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wolf308(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 13:21:05
右侧引物2测序应该是好点。但是有点暗！不过没事！
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wolf308
人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-11-23 10:28:24
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wolf308

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-11-23 10:28:24
右侧引物2测序应该是好点。但是有点暗！不过没事！

暗的原因可能有哪些啊？会是模板量不够吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-11-23 13:14:40
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zhaokexue

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wolf308(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:09:06
引用回帖:
3楼: Originally posted by wolf308 at 2014-11-23 13:14:40
暗的原因可能有哪些啊？会是模板量不够吗？
...

你这个已经很好了，完全可以去测序，分子量小，嵌入的EB少，显色自然要暗一些，还有就是和点样量有关，电泳时多上点样亮度也会增加

[ 发自小木虫客户端 ]
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wolf308
4楼2014-11-23 13:44:35
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