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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物凝胶电泳图
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kehan777

木虫 (小有名气)

[求助] PCR产物凝胶电泳图

请问大家对这个图的PCR反应体系有什么建议吗？
拖带、有二聚体、目的条带不够亮..

其中一条：是该稍微减少模板量，还是增加？
PCR产物凝胶电泳图
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1楼 2013-10-30 09:35:52
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-30 21:00:35
kehan777: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-05 19:24:32
模板提取是不是不是很好啊？浓度低了，增加模板量试一下，反正到时候你切的是你的目的条带。
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2楼2013-10-30 11:32:23
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-10-30 21:00:46
换引物吧，引物的影响很大的。。。好好的设计
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3楼2013-10-30 11:38:52
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wanghx_2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-10-30 21:00:55
首先，你是菌落PCR还是提取的DNA。
如果是DNA，建议纯化后再PCR，如果还是不行就从新设计引物；如果是菌落PCR，建议用菌龄早的小菌落，添加适量的镁离子，再做一次，如果不行就换引物。
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4楼2013-10-30 15:26:57
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hjyxm

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-31 13:09:11
可以尝试提高TM值，还有就是模板量太少，由图可见你的目的条带在500bp左右，用2%的琼脂糖胶试一试，电压低一点！
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好好工作！
5楼2013-10-31 09:45:59
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kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yesucao at 2013-10-30 11:32:23
模板提取是不是不是很好啊？浓度低了，增加模板量试一下，反正到时候你切的是你的目的条带。

如果做PCR产物纯化，而不做胶回收，二聚体和拖带 会不会影响后面的双酶切？因为在双酶切之后，连接之前，我们会再做一次胶回收，但不知道上面所说的影响有多大..
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6楼2013-10-31 21:55:18
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kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wanghx_2012 at 2013-10-30 15:26:57
首先，你是菌落PCR还是提取的DNA。
如果是DNA，建议纯化后再PCR，如果还是不行就从新设计引物；如果是菌落PCR，建议用菌龄早的小菌落，添加适量的镁离子，再做一次，如果不行就换引物。

是以cDNA为模版的..
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7楼2013-10-31 21:56:22
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kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hjyxm at 2013-10-31 09:45:59
可以尝试提高TM值，还有就是模板量太少，由图可见你的目的条带在500bp左右，用2%的琼脂糖胶试一试，电压低一点！

1%琼脂糖，电压100V

左边4个，引物对的Tm：64、72.5  ；我设了67℃
右边4个，引物对的Tm：68.6、68.7  ；我设了65℃

请问提高退火温度、减少退火时间的，具体该怎么增减？
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8楼2013-10-31 22:06:56
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wanghx_2012

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by kehan777 at 2013-10-31 21:56:22
是以cDNA为模版的.....

结合您6楼的回答，建议用回收的纯化的DNA再做一次，你也可以做温度梯度，要是都不行就换引物。
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9楼2013-11-01 13:44:14
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kehan777

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanghx_2012 at 2013-11-01 13:44:14
结合您6楼的回答，建议用回收的纯化的DNA再做一次，你也可以做温度梯度，要是都不行就换引物。...

温度梯度？是降落PCR？还是梯度PCR？这两个都有了解过，但都没真的做过，不知道哪种比较合适。。
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10楼2013-11-01 23:10:20
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