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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求鉴定PCR扩增电泳图
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 求鉴定PCR扩增电泳图

如图，扩增小片段（200多bp），0为空白，1到7为样品，右边俩位markerDL2000。
不是生物专业的，不晓得这算扩增出来了吗？
还有，最上面的那个应该是引物二聚体吗（0号样品也有的那个条带）？
如果要胶回收，切胶的时候要把拖尾的部分也切了吗？
如果要切胶回收，用EB染色紫外光下切，不能超过多久？（怕紫外照久了突变）

门外汉。。。问题比较多。。。谢谢大家了！
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1楼2012-03-13 20:51:37
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344(金币+1): 2012-03-13 23:15:31
这点用质量也太差了，marker都这么模糊
1. 0空白是什么，没有模板么，还是没有引物，还是怎么的？
2. 我想说，这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候，胶浓度高点，2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多长时间吧，一般没事的，毕竟一般切胶的紫外强度不会很大的，尽量快些就好了。
4.小片段有时候不是很好回收，找个适合小片段的试剂盒
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2012-03-13 22:08:23
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fungixx at 2012-03-13 22:08:23:
这点用质量也太差了，marker都这么模糊
1. 0空白是什么，没有模板么，还是没有引物，还是怎么的？
2. 我想说，这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候，胶浓度高点，2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多 ...

谢谢你的耐心解答~

回复你的前两点。

1,空白是模板是无菌水，其他都加了的。
2,胶浓度就是2%的。

想请教一下，为什么不是我要的条带呢？
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3楼2012-03-13 23:13:21
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fungixx at 2012-03-13 22:08:23:
这点用质量也太差了，marker都这么模糊
1. 0空白是什么，没有模板么，还是没有引物，还是怎么的？
2. 我想说，这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候，胶浓度高点，2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多 ...

感觉好像是因为胶做的比较厚所以拍照是灰色的，跑0.8%胶的时候就比较亮。
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4楼2012-03-13 23:17:07
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
继续求鉴定
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5楼2012-03-14 09:37:07
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huangk1199

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344(金币+1): 2012-03-14 14:10:31
1.拖尾严重，适当提高退火温度，减少循环次数。
2.二聚体严重，建议减少引物的浓度，酶保护剂BSA之类的有必要添加。
3.建议你把你的PCR条件晒晒，大家好做具体分析。
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一路蚯蚓
6楼2012-03-14 14:05:00
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by huangk1199 at 2012-03-14 14:05:00:
1.拖尾严重，适当提高退火温度，减少循环次数。
2.二聚体严重，建议减少引物的浓度，酶保护剂BSA之类的有必要添加。
3.建议你把你的PCR条件晒晒，大家好做具体分析。

Taq酶5U/ul加0.1uL，10XBuffer（无Mg）2.5uL，MgCl225mM加2.5uL, dNTP 2.5mM加2uL, 引物10mM各1uL,模板是菌液（枯草菌）,1uL.
升温条件：
94,30s; 94,30s,   52.7, 30s   72, 30s;(循环30次)； 72,5 min

退火温度按oligo6引物分析得的，上游引物33bp（含NdeI位点，保护碱基加的多，所以长）,下游引物27bp。
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7楼2012-03-14 14:18:02
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
8楼2012-03-14 21:36:03
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
baby1_9253344: 金币+3 2012-05-03 14:35:13
从图上看不是非常特异，先提高退火温度试试，软件给的退火温度只供参考，不同软件算出来有时候很不一样。还有下次把胶图正放，即胶孔在上，别问我为什么，习惯。先确定下根据marker，出现的条带大小正确吗？若正确就是PCR条件优化的问题。别只给个DL2000啊，谁记得住那么多marker的条带，可以标下每条的大小。
可能不是很用，但可以帮你把问题弄清楚，找出症结所在，就比较知道下一步要做什么了
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9楼2012-05-03 14:07:25
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