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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 求鉴定PCR扩增电泳图

如图,扩增小片段(200多bp),0为空白,1到7为样品,右边俩位markerDL2000。
不是生物专业的,不晓得这算扩增出来了吗?
还有,最上面的那个应该是引物二聚体吗(0号样品也有的那个条带)?
如果要胶回收,切胶的时候要把拖尾的部分也切了吗?
如果要切胶回收,用EB染色紫外光下切,不能超过多久?(怕紫外照久了突变)

门外汉。。。问题比较多。。。谢谢大家了!
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by huangk1199 at 2012-03-14 14:05:00:
1.拖尾严重,适当提高退火温度,减少循环次数。
2.二聚体严重,建议减少引物的浓度,酶保护剂BSA之类的有必要添加。
3.建议你把你的PCR条件晒晒,大家好做具体分析。

Taq酶5U/ul加0.1uL,10XBuffer(无Mg)2.5uL,MgCl225mM加2.5uL, dNTP 2.5mM加2uL, 引物10mM各1uL,模板是菌液(枯草菌),1uL.
升温条件:
94,30s; 94,30s,   52.7, 30s   72, 30s;(循环30次); 72,5 min

退火温度按oligo6引物分析得的,上游引物33bp(含NdeI位点,保护碱基加的多,所以长),下游引物27bp。
7楼2012-03-14 14:18:02
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
baby1_9253344(金币+1): 2012-03-13 23:15:31
这点用质量也太差了,marker都这么模糊
1. 0空白是什么,没有模板么,还是没有引物,还是怎么的?
2. 我想说,这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候,胶浓度高点,2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多长时间吧,一般没事的,毕竟一般切胶的紫外强度不会很大的,尽量快些就好了。
4.小片段有时候不是很好回收,找个适合小片段的试剂盒
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2012-03-13 22:08:23
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fungixx at 2012-03-13 22:08:23:
这点用质量也太差了,marker都这么模糊
1. 0空白是什么,没有模板么,还是没有引物,还是怎么的?
2. 我想说,这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候,胶浓度高点,2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多 ...

谢谢你的耐心解答~

回复你的前两点。

1,空白是模板是无菌水,其他都加了的。
2,胶浓度就是2%的。

想请教一下,为什么不是我要的条带呢?
3楼2012-03-13 23:13:21
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fungixx at 2012-03-13 22:08:23:
这点用质量也太差了,marker都这么模糊
1. 0空白是什么,没有模板么,还是没有引物,还是怎么的?
2. 我想说,这很可能不是你要的带的。你跑小片段的时候,胶浓度高点,2%或许可能更好些
3. 紫外下切割要不了多 ...

感觉好像是因为胶做的比较厚所以拍照是灰色的,跑0.8%胶的时候就比较亮。
4楼2012-03-13 23:17:07
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