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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 不知道为什么用猪的肠道的cDNA 一直都无法PCR出目的条带
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冰凝草

木虫 (小有名气)

[求助] 不知道为什么用猪的肠道的cDNA 一直都无法PCR出目的条带

最近一直在努力从猪的肠道的cDNA 中PCR出目的条带，是APN这个基因的条带，一开始的时候是使用的DNA，但是由于设计的引物是以mRNA为依据的，所以后来开始换用RNA反转录形成的cDNA，目的条带不是很大，只有3Kb左右，是一开始设计的全长的引物，但是没有结果，所以设计了两段只有500bp 大小的引物，都成功的PCR出目的条带了，鉴定也是对的，所以就又重新设计两段1.5Kb 的引物，为了做重叠PCR，但是还是没有结果。
最后设计的引物的上下游的Tm值相差较大，但是试了48、53、55、57、59之后都是没有条带，不知道是什么原因呢？
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1楼 2012-12-29 22:25:54
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你怎么知道反转录以后有没有剪切。

说不定你的后来1。5kb的就剪切掉了一部分呢。
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2楼2012-12-30 14:53:28
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
冰凝草: 金币+1, ★有帮助, 嗯，可是我已经设计了三次引物了，真核生物好像都挺难做的 2012-12-31 17:09:14
引物、退火温度、酶以及退火变性时间可能都会影响实验结果。我最近在用宝生物的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 酶，感觉不错。直接设置退火以及延伸两步，并且延伸速度也快。我的经验是，如果该酶扩增不成功，最好就是重新设计引物。建议楼主试一下。
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3楼2012-12-31 10:07:29
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冰凝草

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yixuanwin at 2012-12-30 14:53:28
你怎么知道反转录以后有没有剪切。

说不定你的后来1。5kb的就剪切掉了一部分呢。

是说cDNA不完整么？我也是考虑到了这一点，准备重新提RNA再反转录一次
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4楼2012-12-31 17:10:05
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度可以适当提高一下
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5楼2012-12-31 19:00:13
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冰凝草

木虫 (小有名气)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢反馈 2013-01-04 06:57:26
引用回帖:
5楼: Originally posted by lihegang2000 at 2012-12-31 19:00:13
退火温度可以适当提高一下

我从48度到63度都试过了，但还是没有结果
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6楼2013-01-03 20:09:34
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
冰凝草: 金币+2, ★有帮助, 退货温度那么高可以么，我从来没用过63以上的高温。GC含量是挺高的，但是已经添加了DMSO了呢，片段也不算很大，可是500多的小片段可以P出来，但是大段就不行 2013-01-04 15:16:29
引用回帖:
6楼: Originally posted by 冰凝草 at 2013-01-03 20:09:34
我从48度到63度都试过了，但还是没有结果...

1、退火温度可以提高到70度
2、GC含量高的话，要用GC buffer
3、实在不行，可以分两段扩增，然后拼起来
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7楼2013-01-04 08:23:01
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