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pao_pao_

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR出现的条带不清晰，拖带。请教中~~

做PCR了一段时间，可是换了新的引物的情况下，出现了这样一个问题。特来请教。
下面是退火温度梯度的条带图。
每个底物在六个温度下进行了PCR，如图前六个孔是同一个底物，退火温度依次是54、58、、60、62、64、68 摄氏度；
后面六个孔是第二个样本的温度梯度条带。
这样的情况下可能是因为退火温度的问题么？还是什么呢？
我的PCR体系已经用了很久、是20ul的体系,之前的条带一直都很清晰，这次新引物就出现了这样的问题。
PCR出现的条带不清晰，拖带。请教中~~
PCR-BSM梯度-1.gif
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1楼 2013-05-23 18:54:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
pao_pao_(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-24 09:47:34
可能是引物特异性不好。你的目的条带是多大？
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2楼2013-05-24 02:09:34
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pao_pao_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-24 02:09:34
可能是引物特异性不好。你的目的条带是多大？

目的条带是800bp。marker是100-600共六条。引物是参考文献的，不应该有问题啊。不知和退火温度是否有关呢。
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3楼2013-05-27 09:42:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 很有道理哈 2013-05-28 08:23:37
引用回帖:
3楼: Originally posted by pao_pao_ at 2013-05-27 09:42:55
目的条带是800bp。marker是100-600共六条。引物是参考文献的，不应该有问题啊。不知和退火温度是否有关呢。...

参考文献的引物也不一定就非常好，效果如何要自己实验才知道。总的来说，退火温度高的话，特异性提高，下面的小带也少了。说明引物很可能与模板其它位置的序列anealing。PCR的效果不好还可能与模板的质量有关。
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4楼2013-05-28 07:49:59
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