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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】跪求反转录失败的原因
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】跪求反转录失败的原因 已有8人参与



这是我最近提取的RNA电泳图，图本身看上去不太好，所以就测了od值A260/A280为2.0。

接着做反转录，按照takara AMV 3.0反转录试剂盒进行操作。内参的条带很好，但目的基因的条带始终呈弥散状，反转录条件如下设置：
(42度 30分钟，99度 5分钟，5度5分钟) 1循环；

pcr设置：
94度 5分钟；(94度 30秒，52度 30秒，72度 1分钟) 50个循环；72度 7分钟。

设置50个循环是个人觉得cDNA的量较少，根据说明书来调整的。



这是反转录的条带，左边两条带呈弥散状，右边是指示条带，想看看rna抹带在什么位置，如果反转录成功，那么得到的条带应与右边条带位置相同。这两个rna条带是分别用两组引物来反转录的，也试过调整引物、退火温度等，但是已经做了近半年了，依然是这样的条带。求各位帮忙，谢谢!
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1楼 2010-05-06 09:29:48
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-06 22:58:14
你所提取的RNA中有很明显的DNA，在反转以前是否除去？

扩增出来的带呈弥散状但是内参没有问题，有可能是发生了非特异的扩增。先调整体系，更换更合适的引物，提高Tm。用DNA做模板先扩增试试
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2楼2010-05-06 10:15:57
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

跪求反转录失败的原因

reasonspare:DNAase 可以去除DNA 2010-05-13 06:31:58
我用DNA为模板，更换过几批引物均做过pcr,一次产物和二次产物的条带都非常好，但用到反转录上就p不出来了。

关于DNA污染的问题，想请教一下，怎么解决？我用的是Trizol法提取总RNA.
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3楼2010-05-06 22:34:43
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刘仕博

金虫 (著名写手)
★ ★
plantaqp(金币+2):欢迎交流 2010-05-09 03:24:00
首先你的RNA就不是很好。而且我觉得跑胶的结果和OD值没有什么联系吧，不能一个结果好就认识另外一个的结果也会好，因为两个实验的目的是不一样的吧。
还有提取完RNA做下clean up，是不是结果会好些呢~
别人一直都是这么建议我的，呵呵~
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生命在于折腾~
4楼2010-05-07 12:27:54
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

跪求反转录失败的原因

我是跑电泳和测od两个检测方法同时使用的，并没说这两个之间有联系。
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5楼2010-05-08 21:48:07
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plantaqp

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:32:49
对照很好说明转录是没有问题的；
用质粒DNA能P出来说明引物也是没有问题的；因为用DNA模板浓度是很高的，而CDNA中模板浓度低，所以不能排除你引物不是最优选择，退火温度不合适。
另外是不是基因在这个材料中不表达？
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6楼2010-05-09 03:41:09
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
reasonspare:这个比较关键。谢谢。 2010-05-13 06:33:08
你用什么做逆转录？oligo dT？随机引物？还是基因特异引物？
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7楼2010-05-09 08:54:45
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

跪求反转录失败的原因

谢谢你的建议
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8楼2010-05-10 08:56:20
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

跪求反转录失败的原因

我用oligo dT做反转录引物的，
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9楼2010-05-10 08:57:23
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:33:24
xuejinyz1(金币+3): 2010-05-29 15:19:18
建议先用RNA为模板，扩一下内参，看有没有基因组DNA污染。如有，现用无RNA酶的DNA酶处理一下你的RNA样品，再做反转录。
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10楼2010-05-10 11:36:19
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