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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录高手进来~~
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沾欢欢

金虫 (正式写手)

啦啦啦

[求助] 反转录高手进来~~

我提的病毒RNA浓度大概是0.15 微克/微升,反转录用的酶是宝生的M-MLV反转录酶~反转录之后我直接取 1 微升cDNA进行PCR扩增(25微升体系),电泳显示的目标条带很亮,并且也没有引物二聚体.但是呢,我将cDNA稀释十倍以后再取1微升进行PCR扩增,结果全是引物二聚体,几乎看不见目标条带,这是为何?就稀释十倍居然有那么大的差别??
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1楼 2011-10-27 20:49:40
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小小微生物

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-11-02 11:27:57
这么久也没人来回答........我可不是高手，脸皮厚了点而已................可能是 模板浓度降低后，减少了引物与模板接触的概率，从而增加了引物与引物之间接触的概率，所以才会出现上述情况。这是我自己推测的，具体这方面没有做实验去验证，不过你可以做一下这个，感觉也可以做个项目了，题目就叫“不同模板浓度对引物二聚体产生的影响”
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2楼2011-10-30 09:34:37
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laverne

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流! 2011-11-02 11:28:09
找到你合适的模板浓度继续向下进行吧，反转录效率造成的模板起始浓度不高，找个核酸定量仪测一下就可以知道浓度了，pcr反应体系对于模板浓度也是有要求的，一般在10pg－1ug
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为了更好的生活……
3楼2011-11-01 17:24:07
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 有道理! 2011-11-02 11:31:53
干嘛要稀释？？我做PCR的时候cDNA一般都加倍使用啊，模板少的话多余的引物就会结合在一起啊，你是要最后得到靶基因还是探索PCR的条件？？
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4楼2011-11-01 22:31:09
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wcwluwei

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
5楼2011-11-02 21:30:18
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q307078056

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

沾欢欢(金币+1): 2011-11-04 09:23:10
1、cDNA本身就不是很稳定，建议将稀释倍数稍作调整··  可作3*  5* 8* 10* 并增加五个扩增循环看看·
2、稀释cDNA所用到的稀释液是否干净呢··  
3、建议有条件的话，用用一步法的PCR试剂盒试试看？同样将模板做浓度梯度··
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人生不是一种享受，而是一桩沉重异常的工作
6楼2011-11-03 11:45:27
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q307078056

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzqno at 2011-11-01 22:31:09:
干嘛要稀释？？我做PCR的时候cDNA一般都加倍使用啊，模板少的话多余的引物就会结合在一起啊，你是要最后得到靶基因还是探索PCR的条件？？

嗯，确实···

只不过，是否应该考虑到，如果体系中不含模板进行扩增，却也产生大量二聚体，或许也应该考虑PCR体系的优化了·
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人生不是一种享受，而是一桩沉重异常的工作
7楼2011-11-03 11:48:27
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沾欢欢

金虫 (正式写手)

啦啦啦
引用回帖:
4楼: Originally posted by wzqno at 2011-11-01 22:31:09:
干嘛要稀释？？我做PCR的时候cDNA一般都加倍使用啊，模板少的话多余的引物就会结合在一起啊，你是要最后得到靶基因还是探索PCR的条件？？

要做灵敏度试验的话,肯定得稀释cDNA的呀
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8楼2011-11-04 09:23:55
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longrna

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 沾欢欢 at 2011-11-04 09:23:55:
要做灵敏度试验的话,肯定得稀释cDNA的呀

同意。
合的一链就那么一点，如不稀释，要用来qPCR定量的时候完全不够用。

建议提取高浓度的total RNA，然后多用点来合一链以提高cDNA(模板)浓度。我是直接用3-4ug total RNA来合一链的。
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伟大航线....
9楼2011-11-04 09:35:27
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