应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】跪求反转录失败的原因
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 3712  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】跪求反转录失败的原因 已有8人参与



这是我最近提取的RNA电泳图，图本身看上去不太好，所以就测了od值A260/A280为2.0。

接着做反转录，按照takara AMV 3.0反转录试剂盒进行操作。内参的条带很好，但目的基因的条带始终呈弥散状，反转录条件如下设置：
(42度 30分钟，99度 5分钟，5度5分钟) 1循环；

pcr设置：
94度 5分钟；(94度 30秒，52度 30秒，72度 1分钟) 50个循环；72度 7分钟。

设置50个循环是个人觉得cDNA的量较少，根据说明书来调整的。



这是反转录的条带，左边两条带呈弥散状，右边是指示条带，想看看rna抹带在什么位置，如果反转录成功，那么得到的条带应与右边条带位置相同。这两个rna条带是分别用两组引物来反转录的，也试过调整引物、退火温度等，但是已经做了近半年了，依然是这样的条带。求各位帮忙，谢谢!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-05-06 09:29:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

plantaqp

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-05-13 06:32:49
对照很好说明转录是没有问题的；
用质粒DNA能P出来说明引物也是没有问题的；因为用DNA模板浓度是很高的，而CDNA中模板浓度低，所以不能排除你引物不是最优选择，退火温度不合适。
另外是不是基因在这个材料中不表达？
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-05-09 03:41:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-06 22:58:14
你所提取的RNA中有很明显的DNA，在反转以前是否除去？

扩增出来的带呈弥散状但是内参没有问题，有可能是发生了非特异的扩增。先调整体系，更换更合适的引物，提高Tm。用DNA做模板先扩增试试
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-05-06 10:15:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

跪求反转录失败的原因

reasonspare:DNAase 可以去除DNA 2010-05-13 06:31:58
我用DNA为模板，更换过几批引物均做过pcr,一次产物和二次产物的条带都非常好，但用到反转录上就p不出来了。

关于DNA污染的问题，想请教一下，怎么解决？我用的是Trizol法提取总RNA.
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-05-06 22:34:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

刘仕博

金虫 (著名写手)
★ ★
plantaqp(金币+2):欢迎交流 2010-05-09 03:24:00
首先你的RNA就不是很好。而且我觉得跑胶的结果和OD值没有什么联系吧，不能一个结果好就认识另外一个的结果也会好，因为两个实验的目的是不一样的吧。
还有提取完RNA做下clean up，是不是结果会好些呢~
别人一直都是这么建议我的，呵呵~
赞一下(1人) 回复此楼
生命在于折腾~
4楼2010-05-07 12:27:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 070305高分子化学与物理 304分求调剂 +7 c297914 2026-03-28 7/350 2026-03-29 01:17 by 544594351
[考研] 0703化学调剂，求导师收 +9 天天好运来上岸� 2026-03-24 10/500 2026-03-28 22:17 by chemzp
[考研] 学硕274求调剂 +9 Li李鱼 2026-03-26 9/450 2026-03-28 21:42 by bymhappy
[考研] 生物学学硕，一志愿湖南大学，初试成绩338 +6 YYYYYNNNNN 2026-03-26 7/350 2026-03-28 20:52 by 唐沐儿
[考研] 化学0703 调剂 306分 一志愿211 +4 26要上岸 2026-03-28 4/200 2026-03-28 15:30 by 1018329917
[考研] 331环境科学与工程求调剂 +3 熠然好运气 2026-03-27 3/150 2026-03-28 04:11 by fmesaito
[考研] 285求调剂 +4 AZMK 2026-03-27 7/350 2026-03-27 20:59 by AZMK
[考研] 安徽大学专硕生物与医药专业(086000)324分，英语已过四六级，六级521，求调剂 +4 美味可乐鸡翅 2026-03-26 4/200 2026-03-27 15:27 by 星空星月
[考研] 一志愿郑大085600，310分求调剂 +5 李潇可 2026-03-26 5/250 2026-03-27 11:14 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿吉大071010，316分求调剂 +3 xgbiknn 2026-03-27 3/150 2026-03-27 10:36 by guoweigw
[考研] 材料科学与工程 317求调剂 +4 JKSOIID 2026-03-26 4/200 2026-03-26 15:58 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿 南京邮电大学 288分 材料考研 求调剂 +3 jl0720 2026-03-26 3/150 2026-03-26 13:39 by zzll406
[考研] 环境专硕324分求调剂推荐 +5 轩小宁—— 2026-03-26 5/250 2026-03-26 12:05 by i_cooler
[考研] 一志愿中南大学化学学硕0703总分337求调剂 +7 niko- 2026-03-22 7/350 2026-03-25 20:14 by qingfeng258
[考研] 26考研-291分-厦门大学（085601）-柔性电子学院材料工程专业求调剂 +3 min3 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:22 by xcjcqu
[考博] 26申博自荐 +3 whh869393 2026-03-24 3/150 2026-03-24 09:55 by 21018060
[基金申请] 请教下大家 2026年国家基金申请是双盲审吗？ +3 lishucheng1 2026-03-22 5/250 2026-03-24 08:22 by gltch
[考研] 335求调剂 +4 yuyu宇 2026-03-23 5/250 2026-03-23 23:49 by Txy@872106
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 280分求调剂 一志愿085802 +4 PUMPT 2026-03-22 7/350 2026-03-22 22:13 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭