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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】反转录时该选用oligo dT还是 随机6引物？

不太明白什么时候选用oligo dT，什么时候选用随机引物, 求指点
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1楼 2011-01-08 22:48:23
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yucheng9255

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2011-01-09 08:57:44
使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析.
使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.
至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用.
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2楼2011-01-08 23:07:42
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yucheng9255

木虫 (著名写手)
★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2011-01-09 08:57:52
用随机引物时 要去除总RNA中的tRNA rRNA, 只保留mRNA
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-01-08 23:58:48
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligo dT;
如果是内含子或者包括部分内含子，就用random
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4楼2011-01-17 21:26:13
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
视你的实验而定
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5楼2011-01-17 21:26:37
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fzfangtao

木虫 (正式写手)

似乎只是量相同或不同而已

★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
反转录完能P出来就行了
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6楼2011-01-20 18:48:36
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独孤蚕

铁杆木虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
395439楼: Originally posted by wuw579 at 2011-01-17 21:26:13
如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligo dT;
如果是内含子或者包括部分内含子，就用random

mRNA反转录之后的cDNA为模板进行PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉了。所以不知道“内含子...”这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！
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7楼2013-03-20 21:43:41
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果你想要做蛋白表达，就用Oligo dT，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。
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8楼2013-03-22 07:45:52
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暮影

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近在用逆转cDNA为模板扩增CDS序列（3000bp左右），同时用oligodT和random引物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有random能扩出目的带，尤其是中间段和靠近5‘端的CDS区——这结果基本和网上很多资料相吻合——比如随机引物更适合CDS长的、有二级结构的基因。
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9楼2013-03-31 22:15:12
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月霖落

新虫 (初入文坛)
多谢解答！
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10楼2014-06-22 12:12:08
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