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冰凝草

木虫 (小有名气)

[求助] 不知道为什么用猪的肠道的cDNA 一直都无法PCR出目的条带

最近一直在努力从猪的肠道的cDNA 中PCR出目的条带,是APN这个基因的条带,一开始的时候是使用的DNA,但是由于设计的引物是以mRNA为依据的,所以后来开始换用RNA反转录形成的cDNA,目的条带不是很大,只有3Kb左右,是一开始设计的全长的引物,但是没有结果,所以设计了两段只有500bp 大小的引物,都成功的PCR出目的条带了,鉴定也是对的,所以就又重新设计两段1.5Kb 的引物,为了做重叠PCR,但是还是没有结果。
最后设计的引物的上下游的Tm值相差较大,但是试了48、53、55、57、59之后都是没有条带,不知道是什么原因呢?
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
冰凝草: 金币+1, ★有帮助, 嗯,可是我已经设计了三次引物了,真核生物好像都挺难做的 2012-12-31 17:09:14
引物、退火温度、酶以及退火变性时间可能都会影响实验结果。我最近在用宝生物的PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 酶,感觉不错。直接设置退火以及延伸两步,并且延伸速度也快。我的经验是,如果该酶扩增不成功,最好就是重新设计引物。建议楼主试一下。
3楼2012-12-31 10:07:29
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你怎么知道反转录以后有没有剪切。

说不定你的后来1。5kb的就剪切掉了一部分呢。
2楼2012-12-30 14:53:28
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冰凝草

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yixuanwin at 2012-12-30 14:53:28
你怎么知道反转录以后有没有剪切。

说不定你的后来1。5kb的就剪切掉了一部分呢。

是说cDNA不完整么?我也是考虑到了这一点,准备重新提RNA再反转录一次
4楼2012-12-31 17:10:05
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
退火温度可以适当提高一下
5楼2012-12-31 19:00:13
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