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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录后扩增有好几条带
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pygao

金虫 (正式写手)

[求助] 反转录后扩增有好几条带

我的RNA质量很好，反转录后扩增；师妹得到所有的目的条带，但我有两对引物扩增的目的条带像Market，有好几条且很明亮。我们用同样的细胞，但处理方式不同，用经过处理的细胞提RNA，做QRT-PCR。谁能告诉我可能的原因？谢谢！
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1楼2013-03-24 11:25:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-27 13:35:36
可能是引物特异性问题。此外，你的引物是否跨内含子，RNA反转录前是做了DNase消化？
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2楼2013-03-24 11:43:54
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pygao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-24 11:43:54
可能是引物特异性问题。此外，你的引物是否跨内含子，RNA反转录前是做了DNase消化？

谢谢！我没有仔细看引物是否跨内含子，也没有做DNase消化，和师妹做的相同，我们用同样的引物，她的是一条带，我的是多条带，是不是RNA中含有DNA啊，我用mini RNase kit提的RNA，她用trizol提取的。
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3楼2013-03-27 09:49:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-29 16:03:57
引用回帖:
3楼: Originally posted by pygao at 2013-03-27 09:49:20
谢谢！我没有仔细看引物是否跨内含子，也没有做DNase消化，和师妹做的相同，我们用同样的引物，她的是一条带，我的是多条带，是不是RNA中含有DNA啊，我用mini RNase kit提的RNA，她用trizol提取的。...

不管用什么方法提的RNA，反转录前要消化DNA。否则基因组DNA会干扰qPCR。如果引物跨内含子的话，基因组模板P出来的带会与cDNA模板P出的不一样，如果没有跨内含子，两种模板P出同样的带。你的情况很可能是样品里混有基因组DNA，而且引物跨内含子。
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4楼2013-03-27 12:25:47
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得可能是DNA污染的问题
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5楼2013-03-27 12:37:47
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pygao

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-27 12:25:47
不管用什么方法提的RNA，反转录前要消化DNA。否则基因组DNA会干扰qPCR。如果引物跨内含子的话，基因组模板P出来的带会与cDNA模板P出的不一样，如果没有跨内含子，两种模板P出同样的带。你的情况很可能是样品里混有 ...

是的，引物跨内含子了！
但我测定RNA结果很好，我很郁闷！
RNA中含有DNA扩出来就是两条带吗？我扩出来的像marker，大约有10条带，都挺亮的。
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6楼2013-03-29 11:58:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
pygao(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-27 16:41:54
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 16:32:50
引用回帖:
6楼: Originally posted by pygao at 2013-03-29 11:58:02
是的，引物跨内含子了！
但我测定RNA结果很好，我很郁闷！
RNA中含有DNA扩出来就是两条带吗？我扩出来的像marker，大约有10条带，都挺亮的。...

RNA样品里有DNA的话，引物既可以用反转录出来的cDNA为模板，也可以用基因组DNA为模板。如果引物跨内含子，基因组为模板P出来的带要比cDNA模板P出来的大。如果你P出很多条带，说明引物的特异性有问题或者是退火温度不合适。
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7楼2013-03-29 14:54:17
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五维度的爱

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 16:32:57
应该是DNA污染,RNA提出来之后应该先用DNA酶处理之后才能做反转录
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8楼2013-03-31 10:07:14
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zkwwh

新虫 (初入文坛)
我反转录的cDNA可以扩出来100bp的条带，可是扩不出来900bp的条带是什么原因呢？
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9楼2013-12-17 16:20:11
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