24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 6106  |  回复: 6

070250035

银虫 (小有名气)

[求助] 反转录后用cDNA做模板扩不出目的基因怎么办???

各位大侠急急求助啊!

       最近小女子做分子实验颇为不顺!扩出来一个1800多的CDS全长,之后提RNA反转录后用CDNA当模板扩增,咋扩都得不到目的片段,程序和之前扩基因组的是一样的,但是之前一直是好好的很漂亮的带,只是LATaq酶扩的时候会出现一条弱的500bp左右片段,现在反转录后可以得到这个非特异的500bp片段,就是没有1800多的,提高退火温度也不行,提高1度后就什么带都没了!折磨死我了!
   
       求神人帮助!万分感谢!
回复此楼

» 本帖附件资源列表

  • 欢迎监督和反馈:小木虫仅提供交流平台,不对该内容负责。
    本内容由用户自主发布,如果其内容涉及到知识产权问题,其责任在于用户本人,如对版权有异议,请联系邮箱:xiaomuchong@tal.com
  • 附件 1 : 2012-12-15.bmp
  • 2013-01-15 16:54:41, 1.69 M

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

探究知识的海洋
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-18 08:08:46
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达,查一下这个基因表达最高的那个组织(或者多尝试几个组织),然后提取这个组织中的RNA进行,反转录,作为模板,进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer,
如果这个还不行的话,可以尝试嵌套式PCR
祝你好运!
2楼2013-01-16 08:52:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

070250035

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yesali at 2013-01-16 08:52:31
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达,查一下这个基因表达最高的那个组织(或者多尝试几个组织),然后提取这个组织中的RNA进行,反转录,作为模板,进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer,
如果这 ...

在叶片和根都有表达,现在重新反转录,扩出的有接近2000的弱带,切胶回收后再扩却跑出三条很接近的带,都在1500以上,没法判断你哪个是目的序列咋办??而且很近,切的话,区分不开!
探究知识的海洋
3楼2013-01-17 18:44:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦的人1987

金虫 (小有名气)

想问一下,你扩出来的CDS是以DNA为模板还是以RNA为模板啊
4楼2013-01-17 21:08:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

科研屌丝007

新虫 (小有名气)

楼主 你的1800bpCDS序列是从基因组中扩增得到的吧,而你现在以cDNA为模板,那肯定有内含子的影响啊,重新设计引物吧
5楼2013-01-19 22:34:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Lester11

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果从基因组直接扩增会有内含子影响。另外,如果GC含量太高也容易丢失片段
Followyourheart!
6楼2013-01-20 00:10:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丹丹317

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


070250035(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:12:29
是不是模板出现了问题 ,可以重新提RNA然后再反转录成cDAN试试呢,其实这个挺长的,
fighting
7楼2013-07-22 18:46:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 070250035 的主题更新
信息提示
请填处理意见