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070250035

银虫 (小有名气)

[求助] 反转录后用cDNA做模板扩不出目的基因怎么办???

各位大侠急急求助啊!

       最近小女子做分子实验颇为不顺!扩出来一个1800多的CDS全长,之后提RNA反转录后用CDNA当模板扩增,咋扩都得不到目的片段,程序和之前扩基因组的是一样的,但是之前一直是好好的很漂亮的带,只是LATaq酶扩的时候会出现一条弱的500bp左右片段,现在反转录后可以得到这个非特异的500bp片段,就是没有1800多的,提高退火温度也不行,提高1度后就什么带都没了!折磨死我了!
   
       求神人帮助!万分感谢!
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探究知识的海洋
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-18 08:08:46
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达,查一下这个基因表达最高的那个组织(或者多尝试几个组织),然后提取这个组织中的RNA进行,反转录,作为模板,进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer,
如果这个还不行的话,可以尝试嵌套式PCR
祝你好运!
2楼2013-01-16 08:52:31
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070250035

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by yesali at 2013-01-16 08:52:31
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达,查一下这个基因表达最高的那个组织(或者多尝试几个组织),然后提取这个组织中的RNA进行,反转录,作为模板,进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer,
如果这 ...

在叶片和根都有表达,现在重新反转录,扩出的有接近2000的弱带,切胶回收后再扩却跑出三条很接近的带,都在1500以上,没法判断你哪个是目的序列咋办??而且很近,切的话,区分不开!
探究知识的海洋
3楼2013-01-17 18:44:42
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

想问一下,你扩出来的CDS是以DNA为模板还是以RNA为模板啊
4楼2013-01-17 21:08:01
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

楼主 你的1800bpCDS序列是从基因组中扩增得到的吧,而你现在以cDNA为模板,那肯定有内含子的影响啊,重新设计引物吧
5楼2013-01-19 22:34:03
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Lester11

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果从基因组直接扩增会有内含子影响。另外,如果GC含量太高也容易丢失片段
Followyourheart!
6楼2013-01-20 00:10:27
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丹丹317

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


070250035(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:12:29
是不是模板出现了问题 ,可以重新提RNA然后再反转录成cDAN试试呢,其实这个挺长的,
fighting
7楼2013-07-22 18:46:49
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