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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录后用cDNA做模板扩不出目的基因怎么办？？？
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070250035

银虫 (小有名气)

[求助] 反转录后用cDNA做模板扩不出目的基因怎么办？？？

各位大侠急急求助啊！

       最近小女子做分子实验颇为不顺！扩出来一个1800多的CDS全长，之后提RNA反转录后用CDNA当模板扩增，咋扩都得不到目的片段，程序和之前扩基因组的是一样的，但是之前一直是好好的很漂亮的带，只是LATaq酶扩的时候会出现一条弱的500bp左右片段，现在反转录后可以得到这个非特异的500bp片段，就是没有1800多的，提高退火温度也不行，提高1度后就什么带都没了！折磨死我了！
   
       求神人帮助！万分感谢！
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    • 2013-01-15 16:54:41, 1.69 M

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探究知识的海洋
1楼 2013-01-15 16:54:55
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-18 08:08:46
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达，查一下这个基因表达最高的那个组织（或者多尝试几个组织），然后提取这个组织中的RNA进行，反转录，作为模板，进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer，
如果这个还不行的话，可以尝试嵌套式PCR
祝你好运！
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2楼2013-01-16 08:52:31
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070250035

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yesali at 2013-01-16 08:52:31
可能这个基因在你提取RNA所用的组织中不表达，查一下这个基因表达最高的那个组织（或者多尝试几个组织），然后提取这个组织中的RNA进行，反转录，作为模板，进行扩增。
再就是buffer建议用GC-rich buffer，
如果这 ...

在叶片和根都有表达，现在重新反转录，扩出的有接近2000的弱带，切胶回收后再扩却跑出三条很接近的带，都在1500以上，没法判断你哪个是目的序列咋办？？而且很近，切的话，区分不开！
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探究知识的海洋
3楼2013-01-17 18:44:42
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
想问一下，你扩出来的CDS是以DNA为模板还是以RNA为模板啊
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4楼2013-01-17 21:08:01
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)
楼主 你的1800bpCDS序列是从基因组中扩增得到的吧，而你现在以cDNA为模板，那肯定有内含子的影响啊，重新设计引物吧
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5楼2013-01-19 22:34:03
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Lester11

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果从基因组直接扩增会有内含子影响。另外，如果GC含量太高也容易丢失片段
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Followyourheart!
6楼2013-01-20 00:10:27
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丹丹317

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
070250035(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:12:29
是不是模板出现了问题 ，可以重新提RNA然后再反转录成cDAN试试呢，其实这个挺长的，
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fighting
7楼2013-07-22 18:46:49
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