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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] PCR中遇到的问题

请大家帮忙分析一下:我提取RNA反转录后,直接作为模板,用4种不同引物扩增得到的电泳图如下:,,由于各个条带亮度无差别,又将模板稀释10倍,按照同样的程序扩增,得到结果如下:。模板稀释后几乎还是很难看出差别,下一步该如何解决,我第一步稀释模板的想法行不行得通,请各位帮忙分析一下,谢谢!
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不清楚你最终想解决什么问题。
我喜欢默默地被你注视默默地注视着你,我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
2楼2012-07-11 14:14:25
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-12 16:56:26
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-07-13 16:07:02
如果引物是同一的,那么扩出来的产物应该是大小片段一样的。如果引物不是相同的,而产物片段大小恰巧一样大,也应该在同一直线上。而,你这里的电泳图,呈有规律的波动形状,应该是你电泳时,有些胶没有被缓冲液淹没住,或者是胶不均匀,导致上面的缓冲液层不均匀,受电不均匀。建议你使用多一些电泳缓冲液试试。(个人见解,不正之处还请原谅)
3楼2012-07-11 15:45:35
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20111987

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by dingxiuying at 2012-07-11 14:14:25
不清楚你最终想解决什么问题。

我这是用不同引物扩增出的条带,想从电泳图中看到每种目的基因表达量的差别,不知道应该如何解决?
4楼2012-07-12 16:54:25
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20111987

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by dafeizizhu at 2012-07-11 15:45:35
如果引物是同一的,那么扩出来的产物应该是大小片段一样的。如果引物不是相同的,而产物片段大小恰巧一样大,也应该在同一直线上。而,你这里的电泳图,呈有规律的波动形状,应该是你电泳时,有些胶没有被缓冲液淹没 ...

谢谢,我当时也没太注意,可能有这个原因吧,我下次会注意避免的,谢谢提醒!
5楼2012-07-12 16:56:06
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-13 16:07:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by 20111987 at 2012-07-12 16:54:25
我这是用不同引物扩增出的条带,想从电泳图中看到每种目的基因表达量的差别,不知道应该如何解决?...

这么说你要做的是半定量。
我觉得你要半定量的话,就要保证最初用于反转录的总RNA量需要一样,反转录后再PCRr时各组分的量要一致。如果前面控制的很好,扩增出的条带亮度几乎一致的话,说明这几个目的基因的表达量差别不大。

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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你,我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
6楼2012-07-13 08:55:56
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20111987

金虫 (正式写手)

送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by dingxiuying at 2012-07-13 08:55:56
这么说你要做的是半定量。
我觉得你要半定量的话,就要保证最初用于反转录的总RNA量需要一样,反转录后再PCRr时各组分的量要一致。如果前面控制的很好,扩增出的条带亮度几乎一致的话,说明这几个目的基因的表达量 ...

嗯,对,我就是这个目的,因为我们实验条件有限,不能准确知道最初的RNA浓度,所以我就想用内参引物来扩增反转录后的cDNA,用内参基因的亮度来调节使模板浓度一致,再看其它基因的表达量,不知道这样可行不?
7楼2012-07-14 11:01:26
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
20111987: 金币+2, ★有帮助 2012-07-14 15:36:08
如果实验条件有限不能准确知道核酸浓度的话,可以与Maker对照,将样品梯度稀释后跑电泳,从Maker的浓度来估算核酸的浓度。
8楼2012-07-14 13:27:44
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
20111987: 金币+8, ★★★很有帮助 2012-07-15 16:42:16
个人认为普通PCR(终点法)定量模板的量是不可取的,定量的前体是梯度稀释后可以做出标准曲线。事实上,只有在苛刻的条件的,设定好扩增循环(一般不是35循环)下,才有可能,模板的含量与PCR产物电泳的亮度成线性关系。如果模板中有抑制剂(如用trozol法提取RNA后直接做RT),常会出现模板稀释后P出的带反而更亮(不信你试试)。如果有条件,或有经费到其他的开放实验室,应该做荧光定量PCR,但是评价你方法的好坏的依然主要是标曲好不好。
9楼2012-07-14 23:30:53
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