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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR中遇到的问题
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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] PCR中遇到的问题

请大家帮忙分析一下：我提取RNA反转录后，直接作为模板，用4种不同引物扩增得到的电泳图如下：，，由于各个条带亮度无差别，又将模板稀释10倍，按照同样的程序扩增，得到结果如下：。模板稀释后几乎还是很难看出差别，下一步该如何解决，我第一步稀释模板的想法行不行得通，请各位帮忙分析一下，谢谢！
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1楼 2012-07-10 15:41:03
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不清楚你最终想解决什么问题。
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我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
2楼2012-07-11 14:14:25
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-12 16:56:26
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极应助 2012-07-13 16:07:02
如果引物是同一的，那么扩出来的产物应该是大小片段一样的。如果引物不是相同的，而产物片段大小恰巧一样大，也应该在同一直线上。而，你这里的电泳图，呈有规律的波动形状，应该是你电泳时，有些胶没有被缓冲液淹没住，或者是胶不均匀，导致上面的缓冲液层不均匀，受电不均匀。建议你使用多一些电泳缓冲液试试。(个人见解，不正之处还请原谅)
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3楼2012-07-11 15:45:35
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dingxiuying at 2012-07-11 14:14:25
不清楚你最终想解决什么问题。

我这是用不同引物扩增出的条带，想从电泳图中看到每种目的基因表达量的差别，不知道应该如何解决？
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4楼2012-07-12 16:54:25
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dafeizizhu at 2012-07-11 15:45:35
如果引物是同一的，那么扩出来的产物应该是大小片段一样的。如果引物不是相同的，而产物片段大小恰巧一样大，也应该在同一直线上。而，你这里的电泳图，呈有规律的波动形状，应该是你电泳时，有些胶没有被缓冲液淹没 ...

谢谢，我当时也没太注意，可能有这个原因吧，我下次会注意避免的，谢谢提醒！
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5楼2012-07-12 16:56:06
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dingxiuying

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-13 16:07:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by 20111987 at 2012-07-12 16:54:25
我这是用不同引物扩增出的条带，想从电泳图中看到每种目的基因表达量的差别，不知道应该如何解决？...

这么说你要做的是半定量。
我觉得你要半定量的话，就要保证最初用于反转录的总RNA量需要一样，反转录后再PCRr时各组分的量要一致。如果前面控制的很好，扩增出的条带亮度几乎一致的话，说明这几个目的基因的表达量差别不大。
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20111987
我喜欢默默地被你注视默默地注视着你，我喜欢深深地被你爱着深深地爱着你
6楼2012-07-13 08:55:56
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20111987

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by dingxiuying at 2012-07-13 08:55:56
这么说你要做的是半定量。
我觉得你要半定量的话，就要保证最初用于反转录的总RNA量需要一样，反转录后再PCRr时各组分的量要一致。如果前面控制的很好，扩增出的条带亮度几乎一致的话，说明这几个目的基因的表达量 ...

嗯，对，我就是这个目的，因为我们实验条件有限，不能准确知道最初的RNA浓度，所以我就想用内参引物来扩增反转录后的cDNA，用内参基因的亮度来调节使模板浓度一致，再看其它基因的表达量，不知道这样可行不？
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7楼2012-07-14 11:01:26
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
20111987: 金币+2, ★有帮助 2012-07-14 15:36:08
如果实验条件有限不能准确知道核酸浓度的话，可以与Maker对照，将样品梯度稀释后跑电泳，从Maker的浓度来估算核酸的浓度。
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8楼2012-07-14 13:27:44
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nmhsd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
20111987: 金币+8, ★★★很有帮助 2012-07-15 16:42:16
个人认为普通PCR（终点法）定量模板的量是不可取的，定量的前体是梯度稀释后可以做出标准曲线。事实上，只有在苛刻的条件的，设定好扩增循环（一般不是35循环）下，才有可能，模板的含量与PCR产物电泳的亮度成线性关系。如果模板中有抑制剂（如用trozol法提取RNA后直接做RT），常会出现模板稀释后P出的带反而更亮（不信你试试）。如果有条件，或有经费到其他的开放实验室，应该做荧光定量PCR，但是评价你方法的好坏的依然主要是标曲好不好。
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9楼2012-07-14 23:30:53
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