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上官慧

铁虫 (初入文坛)

[求助] 提取RNA后，反转录后用β-actinpcr很多条带

反转录很多次，用的是takara的反转录试剂盒。用β-actin都没p出来。β-actinpcr后条带很多，在目的条带处阴性对照跟基因组dna都pcr出来了。很是郁闷，请各位虫友帮忙解决~~

这是我提的rna

这是我β-actin的结果，第一个是阴性没加反转录酶的rna。β-actin产物在c



[ Last edited by 上官慧 on 2012-5-17 at 09:26 ]
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1楼 2012-05-17 09:18:52
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-17 14:41:11
actin出那么多带可能是你的引物特异性不好，或者是不是你的模版被污染了啊？还有你的说明不是很明白，按理说阴性的话应该是没有带的，你的却出带了，很有可能是你的模版被污染了！
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2楼2012-05-17 10:02:18
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上官慧

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by friya0910 at 2012-05-17 10:02:18:
actin出那么多带可能是你的引物特异性不好，或者是不是你的模版被污染了啊？还有你的说明不是很明白，按理说阴性的话应该是没有带的，你的却出带了，很有可能是你的模版被污染了！

是几次反转录的cDNA用作模板都是这个结果，目标条带是211bp，用的marker是DL500.模板是翻转后就用了，按说也没什么机会污染的。
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3楼2012-05-17 10:12:02
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 上官慧 at 2012-05-17 10:12:02:
是几次反转录的cDNA用作模板都是这个结果，目标条带是211bp，用的marker是DL500.模板是翻转后就用了，按说也没什么机会污染的。

Marker最亮的带是多大啊？
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4楼2012-05-17 10:29:16
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上官慧

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by friya0910 at 2012-05-17 10:29:16:
Marker最亮的带是多大啊？

是200
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5楼2012-05-17 10:39:36
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 上官慧 at 2012-05-17 10:39:36:
是200

其实我还是部太能看明白你的描述，你所有的孔都是用actin的引物P的吗？还是也用了你的目的基因的引物啊？
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6楼2012-05-17 10:44:19
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上官慧

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by friya0910 at 2012-05-17 10:44:19:
其实我还是部太能看明白你的描述，你所有的孔都是用actin的引物P的吗？还是也用了你的目的基因的引物啊？

只用的是actin的引物p的
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7楼2012-05-17 11:08:04
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gaoyang636

木虫 (著名写手)
反转录结束后定量了没有？
稀释了多少倍做的模板？
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8楼2012-05-17 12:02:03
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上官慧

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gaoyang636 at 2012-05-17 12:02:03:
反转录结束后定量了没有？
稀释了多少倍做的模板？

反转录之后没有定量，应该怎么定量呢？50ul的体系，加1ul的模板。模板浓度0.1ug/ul
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9楼2012-05-17 12:07:23
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-17 14:41:23
我大概明白了你的意思了，你的第一条亮带就是在marker200的那个应该就是你的目的带啊，其它的应该是非特异性扩增，最下面糊的那条是引物二聚体，你这不叫没P出来，你这明明就是P出来了啊，只是引物特意性不好，至于你说的阴性对照，我觉得一般没有像你这样设的吧，一般是不加模版P一下吧！希望对您有帮助。
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10楼2012-05-17 13:28:35
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