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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么用cDNA做模板的PCR感觉很不稳定啊
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泰州木虫

金虫 (小有名气)

[求助] 为什么用cDNA做模板的PCR感觉很不稳定啊已有2人参与

最近在拉一个基因的CDs部分，不知道是什么原因，用梯度PCR优化退火温度，根据梯度PCR结果设定的温度，就木有带的情况。两次所用的PCR条件是完全一致的。
我这是用oligo(dT) 引物反转录的cDNA模板，换了好多引物都出现类似的结果。
基因的GC搞会不会出现这样的情况？ 还是说是模板的原因？

总共就1kb多的基因CDs，扩不出来真是说不过去啊。
哪位有经验的还望指点一下

为什么用cDNA做模板的PCR感觉很不稳定啊
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just do it!
1楼2014-07-24 20:24:45
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回帖置顶 ( 共有1个 )

usky_4

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, MolEPI+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:24
泰州木虫: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-25 09:29:31
假定你要的产物的确有表达，而且你的cDNA也没问题的话，那么考虑GC含量是一个方面。GC高的话第一是不容易扩增，第二还有可能缺失片断。如果你的聚合酶有GC enhancer的话可以加一些试一下，会有帮助的。我曾经有克隆过一个总长1.5k的片段，其中有一段GC%有百分之八九十，就很容易扩增失败或者是缺失序列。加了GC enhancer就好了。

其次就是你的酶，如果你的序列GC含量高的话，那么普通的酶是很难扩出来东西的。最好用好一些的，我个人最喜欢用的是Invitrogen的Pfx，刚才说的那个问题就是用Pfx+GC enhancer解决的。而且我后来用普通Taq酶作菌液PCR的时候就很难得到目的片段，也是由于普通Taq酶不给力的问题。再次说明酶是个比较重要的因素，尤其GC高的时候。

再次就是PCR反应了。说实话66度感觉挺高的，一般我很少会用到这么高温，不过当然也可能跟你设计引物有关。可以试着做个梯度还有就是延伸时间注意要够长。

暂时想到这么多吧。
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下次再见面的时候，我们一定会笑着相遇吧
3楼2014-07-24 20:43:09
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普通回帖

wei8020

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
泰州木虫(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-24 21:22:11
泰州木虫: 金币+9, ★★★很有帮助 2014-07-25 09:34:11
有可能是pcr仪不稳定，或者标称温度不准确，解决办法就是还跑同样的梯度程序，把你的样品放在对应的那一行孔里面，这样能保证条件一致。
另一方面，你确定这个基因在你提RNA的组织中表达量高吗？尝试换个表达量高的组织提RNA，会扩的好些。
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2楼2014-07-24 20:31:50
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泰州木虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by usky_4 at 2014-07-24 20:43:09
假定你要的产物的确有表达，而且你的cDNA也没问题的话，那么考虑GC含量是一个方面。GC高的话第一是不容易扩增，第二还有可能缺失片断。如果你的聚合酶有GC enhancer的话可以加一些试一下，会有帮助的。我曾经有克隆 ...

非常感谢，我换条件试试。
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4楼2014-07-25 09:29:34
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泰州木虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wei8020 at 2014-07-24 20:31:50
有可能是pcr仪不稳定，或者标称温度不准确，解决办法就是还跑同样的梯度程序，把你的样品放在对应的那一行孔里面，这样能保证条件一致。
另一方面，你确定这个基因在你提RNA的组织中表达量高吗？尝试换个表达量高的 ...

要真是PCR仪不稳定那就纠结了，基因表达量还是不算低的。
问个问题啊: 用oligo(dT)引物，(dT)重复数对反转录的cDNA结果影响大么?
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just do it!
5楼2014-07-25 09:34:03
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wei8020

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 泰州木虫 at 2014-07-25 09:34:03
要真是PCR仪不稳定那就纠结了，基因表达量还是不算低的。
问个问题啊: 用oligo(dT)引物，(dT)重复数对反转录的cDNA结果影响大么?...

18个就足够长了，再长也没有影响了。我一般建议oligodT后面跟一个V（A,C,G），即5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTV，这样引物会结合到polyA的起始位置，更好用些。
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6楼2014-07-25 11:39:39
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泰州木虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wei8020 at 2014-07-25 11:39:39
18个就足够长了，再长也没有影响了。我一般建议oligodT后面跟一个V（A,C,G），即5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTV，这样引物会结合到polyA的起始位置，更好用些。...

xiexie
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7楼2014-07-25 12:15:41
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Catherine92

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-25 13:53:06
GC含量高的情况，我也遇到过，对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer。LZ可以搜搜看Genloci牌的。
几点建议：
先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实也不用刻意加高
主要是变性温度，预变性96度5分钟然后再加酶（热启动）
一般循环的变性温度用95度比94好，还不行还可以再加高
还有DMSO和甘油，各加到5％就足够了，光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降
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8楼2014-07-25 12:31:15
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泰州木虫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Catherine92 at 2014-07-25 12:31:15
GC含量高的情况，我也遇到过，对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer。LZ可以搜搜看Genloci牌的。
几点建议：
先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实 ...

变性温度，加DMSO，好的，谢谢！
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9楼2014-07-25 20:27:38
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