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有没有什么好方法来挑选阳性克隆
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最近一直在用gate way来重组pDONR质粒，两个目的片段，1个用的DNA模板是基因组基因，长6Kb左右，另一个是cDNA模板，长2Kb。 做了有半个月了，原先以为肯定是短的cDNA先做出来，没想到现在大的做出来了，2kb的片段却怎么也找不到阳性克隆。 cDNA模板浓度似乎不高，pcr产物在割胶回收后浓度一般为70-100ng/ul。BP反应后转化DHa5后板子上能长出20多个菌落，因为菌落PCR所有的菌落条带都是一样的，很多条带，其中一条比较亮，我就以为都是阳性，第二天提取质粒电泳比对大小后却发现都没插进去。 于是，又重新PCR，重新割胶回收，努力提高浓度，昨天转化完，37度培养了约16小时，今天来一看发现长出了好多菌落。大概能有上百个了，有大有小。打算下午一会儿硬着头皮再做次菌落PCR吧，可隐隐觉得结果会跟上次一样，做了也没办法分辨阳性克隆。 所以，各位高手能不能教教我怎么用肉眼分辨菌落呢？那些星星点点的菌落是不是就可以直接忽略了？一般成功率高的转化大概长几个菌落比较靠谱？菌落是不是长的越多越好？PS，我之前克隆6kb的目的片段成功的板子上一次只长了1个菌落，一次长了3个菌落。所以我现在看到越多菌落的板子心情立马不好了。 |
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