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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做克隆挑斑有什么技巧吗？
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longyh6411

金虫 (小有名气)

[求助] 做克隆挑斑有什么技巧吗？

做克隆挑斑有什么技巧吗？咋样才能挑到更多的阳性呢？
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1楼 2012-12-08 23:17:27
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个没有什么技巧吧，完全取决于你的连接的阳性率，你的载体质粒有没有酶切开，单酶切载体有没有去磷酸化，实验过程中有没有完整质粒污染，应该在这些方面加强控制
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2楼2012-12-08 23:38:34
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
挑那些长得比较均匀的菌落，如果周围有很小的，那些不要挑，基本上没有东西，其他的就是看你的运气了……
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
3楼2012-12-09 10:08:30
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严春秋
4楼2012-12-09 11:03:52
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yylin1984

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
（1）挑斑前在4度保存24小时，不要选用蓝色晕纹的；（2）挑斑后用酶切检测和PCR检测是否是阳性；
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112
5楼2012-12-09 11:47:03
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
或许你可以先用菌落PCR做一筛选
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6楼2012-12-09 13:51:22
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般应该挑长得大小适当（根据你的菌株和培养时间而定），没有其他克隆粘连的。
一般建议用菌体PCR鉴定，可以高通量检测可能的阳性克隆。
但是最后还是需要酶切鉴定的。
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7楼2012-12-09 16:34:37
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
挑菌的话，最好挑比较大的，因为阳性的话会长的快一点，同时注意别碰到周围的菌落。
然后再做菌液PCR验证下。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
8楼2012-12-09 18:20:22
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fayzhao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
longyh6411: 金币+100, ★有帮助 2013-01-13 11:34:54
和连接效率相关吧，我上次挑的基本都是阳性，并且也没做什么蓝白斑筛选，就是随机挑的。
菌落PCR验证时，可以把菌挑下来之后在10ul dd水中吹打混匀，以1ul作为模板做PCR，其他的用来摇菌。
在这之前可以先把PCR的其他组分加好，最后加模板。
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9楼2012-12-10 21:14:05
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nmhsd

木虫 (正式写手)
多挑！一定要多挑，一个也是做，十个也是做，挑多了，最多就是多扔几个离心管，一点培养基吗？
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10楼2013-03-08 00:29:26
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