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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。 已有4人参与

各位师兄师姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麦——小麦，从大麦中查找的序列，然后设计的引物，模板是小麦的cdna，一般情况下跑出来得条带是弥散的。有条带的大小也和预计的不一样，预计大小在1300bp左右，看图片上的条带都超过2000bp了。
不知道哪里出现了问题，模板前些日子刚用tubling扩了一次，都是有条带的。

第二个问题：为什么第二幅图的条带都是连续的两条？我以前用小孔（10微升体系）的胶能扩出来一条1300bp的，但是换了大孔（20微升体系）的胶（为了回收）怎么就扩不出来了呢。

我用的酶是方塔高保真酶。
体系（10微升）：酶                     0.2
                           引物1、引物2：各0.4
                          buffer：                5
                          dntp:                    0.2
                          水                           3.6
                          模板：                  0.1

pcr反应条件：95——3min
                     95 ——15s
                     53——15s(有条带的那张)、65——15s(以前一直没有条带弥散，所以一直升高退火温度，可是还没有。。。)
                       72——1min30s
                    72—— 5min

一共33循环。
麻烦各位老师，师兄师姐帮我看看。

PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。
1.jpg


PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。-1
1`.jpg
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1楼 2015-03-23 20:43:29
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-24 23:12:09
原因有很多啊
1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解
2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可）
3 buffer的质量（或者说是PCR试剂盒的质量吧）及buffer里是否有镁离子，可以适当对镁离子浓度进行优化，也可以加DMSO有助于扩增
4 你现在是没有条带扩增出来，应该降低退火温度，当你扩增出有很多杂带的情况下才应该升高退火温度
5 也可适当的减少循环次数
6 还有跑胶时候的电压问题，制胶的胶的质量
7 用水问题，水的pH值也会有影响，不能太酸
因为现在不知道问题在哪，所以在简单的原因也要考虑其中啊
希望早日找到 问题所在
赞一下(4人) 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-24 09:02:51
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没扩增出来，引物或者模板的问题吧
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3楼2015-03-24 12:03:40
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 09:02:51
原因有很多啊
1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解
2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可）
3 buffer的质量（或者 ...

谢谢您，我先按照您说的方法试试。
我觉得应该是引物设计的问题，因为我想克隆全长，我就在查到了这个大麦序列ATG前面大约100bp左右的序列，TGA后面100多bp左右的序列
，然后把拿到的引物在近缘物种小麦（大麦——小麦）中去扩增的，不知道是不是我设计引物的思路就是错误的了？
还有，请问如何提高模板纯度，是不是反转的CDNA还要再进行纯化？
这个模板我用tubling引物扩过，是有条带的，他们说这就证明模板没有讲解。
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4楼2015-03-24 12:32:25
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秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2015-03-24 12:03:40
没扩增出来，引物或者模板的问题吧

请问同源克隆的话引物如何设计才能克隆出从ATG到TGA的全长?
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5楼2015-03-24 12:51:20
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yili_90

金虫 (正式写手)
先找循环数。29X就够了。如果没有就加高退货温度2到3度。如果还是没有，那就降低引物浓度。最好终浓度为0.2uM。如果还是没有，那就稀释模板
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plummet
6楼2015-03-24 12:55:57
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 秦始皇faq at 2015-03-24 12:51:20
请问同源克隆的话引物如何设计才能克隆出从ATG到TGA的全长?...

这个看运气
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7楼2015-03-24 15:29:16
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zhouking8758

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果序列同源，先找到所有同源序列，做alignment，然后根据比对结果再设计简并引物。用简并引物扩增。
另外可以用普通taq就可以了。
看你的图应该是没有目标产物，先分析引物是否有问题(是否是简并引物，引物序列是否正确)，然后优化pcr过程(如采用降落pcr等)
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8楼2015-03-25 00:06:36
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aini_222925

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
模板加的有点少，引物加的有点多。调整一下后扩大反应体系试试。
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我是疯子我怕谁
9楼2015-03-26 17:20:28
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