| 查看: 5530 | 回复: 8 | ||
[求助]
PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。 已有4人参与
|
|
各位师兄师姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麦——小麦，从大麦中查找的序列，然后设计的引物，模板是小麦的cdna，一般情况下跑出来得条带是弥散的。有条带的大小也和预计的不一样，预计大小在1300bp左右，看图片上的条带都超过2000bp了。 不知道哪里出现了问题，模板前些日子刚用tubling扩了一次，都是有条带的。 第二个问题：为什么第二幅图的条带都是连续的两条？我以前用小孔（10微升体系）的胶能扩出来一条1300bp的，但是换了大孔（20微升体系）的胶（为了回收）怎么就扩不出来了呢。 我用的酶是方塔高保真酶。 体系（10微升）：酶 0.2 引物1、引物2：各0.4 buffer： 5 dntp: 0.2 水 3.6 模板： 0.1 pcr反应条件：95——3min 95 ——15s 53——15s(有条带的那张)、65——15s(以前一直没有条带弥散，所以一直升高退火温度，可是还没有。。。) 72——1min30s 72—— 5min 一共33循环。 麻烦各位老师，师兄师姐帮我看看。  1.jpg  1`.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有212人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 3RACE PCR条带弥散，测序结果为载体，求助
已经有5人回复
- PCR后可以看到目的条带，但为什么目的条带上方有弥散？
已经有8人回复
- 半年了，16S rDNA V3区PCR产物弥散，疑似比目的条带大一些些的杂带？
已经有7人回复
- PCR大侠们,我的PCR结果怎么会这样：条带很宽，有些还弥散
已经有18人回复
- 快开学了.....研究生生涯即将开始,各位师兄师姐师弟师妹,有没有要嘱咐的呢?
已经有21人回复
- 求助师兄师姐~有关于巢式PCR的问题~~help
已经有11人回复
- PCR条带弥散是什么原因啊？
已经有7人回复
- 琼脂板上长不出菌落是什么原因
已经有12人回复
- PCR产物再次PCR无条带 只有弥散
已经有18人回复
- PCR产物电泳，条带弥散的原因
已经有16人回复
- 【求助】请教cDNA-AFLP 实验的相关问题，请大家帮忙看看，谢谢
已经有15人回复
- 求助，为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会比maker最大分子量还要大呢？？
已经有7人回复
- 求高手指点：RT-PCR的引物设计
已经有18人回复
- 3‘RACE inner PCR 电泳结果总是有弥散现象回收条带不成带状什么原因啊？
已经有17人回复
- pcr产物 MspI（Takara）酶切条带弥散 原因
已经有5人回复
- 【求助/交流】PCR产物电泳条带弥散？？？
已经有30人回复
18761615793
木虫 (正式写手)
小虫
- MolEPI: 1
- 应助: 172 (高中生)
- 金币: 646.4
- 散金: 170
- 红花: 16
- 帖子: 863
- 在线: 144.9小时
- 虫号: 3603131
- 注册: 2014-12-19
- 专业: 抗体工程学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-24 23:12:09
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-24 23:12:09
|
原因有很多啊 1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解 2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可） 3 buffer的质量（或者说是PCR试剂盒的质量吧）及buffer里是否有镁离子，可以适当对镁离子浓度进行优化，也可以加DMSO有助于扩增 4 你现在是没有条带扩增出来，应该降低退火温度，当你扩增出有很多杂带的情况下才应该升高退火温度 5 也可适当的减少循环次数 6 还有跑胶时候的电压问题，制胶的胶的质量 7 用水问题，水的pH值也会有影响，不能太酸 因为现在不知道问题在哪，所以在简单的原因也要考虑其中啊 希望早日找到 问题所在  |
2楼2015-03-24 09:02:51
jurkat.1640
至尊木虫 (文坛精英)
- MolEPI: 1
- 应助: 908 (博后)
- 金币: 17148.7
- 散金: 1654
- 红花: 121
- 沙发: 41
- 帖子: 14518
- 在线: 2183.8小时
- 虫号: 514340
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
3楼2015-03-24 12:03:40
4楼2015-03-24 12:32:25
5楼2015-03-24 12:51:20
yili_90
金虫 (正式写手)
- 应助: 37 (小学生)
- 贵宾: 0.013
- 金币: 3136.5
- 散金: 400
- 红花: 11
- 帖子: 464
- 在线: 117.7小时
- 虫号: 2157293
- 注册: 2012-11-30
- 性别: MM
- 专业: 动物遗传学
6楼2015-03-24 12:55:57
jurkat.1640
至尊木虫 (文坛精英)
- MolEPI: 1
- 应助: 908 (博后)
- 金币: 17148.7
- 散金: 1654
- 红花: 121
- 沙发: 41
- 帖子: 14518
- 在线: 2183.8小时
- 虫号: 514340
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
7楼2015-03-24 15:29:16
zhouking8758
木虫 (正式写手)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 2418.5
- 散金: 27
- 红花: 2
- 帖子: 369
- 在线: 289.9小时
- 虫号: 691834
- 注册: 2009-01-12
- 专业: 生物大分子结构与功能
8楼2015-03-25 00:06:36
aini_222925
金虫 (初入文坛)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 748.3
- 帖子: 32
- 在线: 16.9小时
- 虫号: 3301627
- 注册: 2014-07-01
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
9楼2015-03-26 17:20:28
