应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。
51/1返回列表
查看: 5344  |  回复: 8
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。已有4人参与

各位师兄师姐，我最近一直在做PCR，想同源克隆大麦——小麦，从大麦中查找的序列，然后设计的引物，模板是小麦的cdna，一般情况下跑出来得条带是弥散的。有条带的大小也和预计的不一样，预计大小在1300bp左右，看图片上的条带都超过2000bp了。
不知道哪里出现了问题，模板前些日子刚用tubling扩了一次，都是有条带的。

第二个问题：为什么第二幅图的条带都是连续的两条？我以前用小孔（10微升体系）的胶能扩出来一条1300bp的，但是换了大孔（20微升体系）的胶（为了回收）怎么就扩不出来了呢。

我用的酶是方塔高保真酶。
体系（10微升）：酶                     0.2
                           引物1、引物2：各0.4
                          buffer：                5
                          dntp:                    0.2
                          水                           3.6
                          模板：                  0.1

pcr反应条件：95——3min
                     95 ——15s
                     53——15s(有条带的那张)、65——15s(以前一直没有条带弥散，所以一直升高退火温度，可是还没有。。。)
                       72——1min30s
                    72—— 5min

一共33循环。
麻烦各位老师，师兄师姐帮我看看。

PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。
1.jpg


PCR条带弥散，不知道是什么原因，希望各位师兄师姐帮我看看。-1
1`.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2015-03-23 20:43:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yili_90

金虫 (正式写手)
先找循环数。29X就够了。如果没有就加高退货温度2到3度。如果还是没有，那就降低引物浓度。最好终浓度为0.2uM。如果还是没有，那就稀释模板
赞一下(1人) 回复此楼
plummet
6楼2015-03-24 12:55:57
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-03-24 23:12:09
原因有很多啊
1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解
2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可）
3 buffer的质量（或者说是PCR试剂盒的质量吧）及buffer里是否有镁离子，可以适当对镁离子浓度进行优化，也可以加DMSO有助于扩增
4 你现在是没有条带扩增出来，应该降低退火温度，当你扩增出有很多杂带的情况下才应该升高退火温度
5 也可适当的减少循环次数
6 还有跑胶时候的电压问题，制胶的胶的质量
7 用水问题，水的pH值也会有影响，不能太酸
因为现在不知道问题在哪，所以在简单的原因也要考虑其中啊
希望早日找到 问题所在
赞一下(4人) 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
2楼2015-03-24 09:02:51
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
没扩增出来，引物或者模板的问题吧
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-24 12:03:40
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

秦始皇faq

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-03-24 09:02:51
原因有很多啊
1 确定模板的纯度（不纯可能会有抑制PCR的东西），确定模板没有降解
2 引物的特异性太差了，或者酶的特异性太差（一般建议1300bp不使用高保真聚合酶，一般的热启动Taq酶即可）
3 buffer的质量（或者 ...

谢谢您，我先按照您说的方法试试。
我觉得应该是引物设计的问题，因为我想克隆全长，我就在查到了这个大麦序列ATG前面大约100bp左右的序列，TGA后面100多bp左右的序列
，然后把拿到的引物在近缘物种小麦（大麦——小麦）中去扩增的，不知道是不是我设计引物的思路就是错误的了？
还有，请问如何提高模板纯度，是不是反转的CDNA还要再进行纯化？
这个模板我用tubling引物扩过，是有条带的，他们说这就证明模板没有讲解。
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-24 12:32:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 9 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭