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植语金虫 (小有名气)
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PCR大侠们,我的PCR结果怎么会这样：条带很宽，有些还弥散
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这是我最近一次做的PCR，中间一个很亮的条带是目标条带（阳性对照的，288bp），其他的条带大概是从目标条带的位置到引物二聚体间的宽带，有些像是有弥散，看不出有目标条带！为什么会是这样？mark分别是500,400,300，200,150,100,50 DSC01160_副本_副本.jpg |
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楼主的PCR是出现了出现片状拖带或涂抹带 （更正，上一楼那贴刚写好，有些地方编辑错了） 2013年8月21日总结 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有： 减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。 改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。或者加强Taq DNA聚合酶的专一性。 酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起没浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。 在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以Taq DNA聚合酶。 适当减少dNTP的浓度；减少减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓 度通行偶联进行，但是不必按同样的比例。 适当降低Mg2+浓 度，以每次0.5mol/L递减不要低于1.0mol/L。 4.保证DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。 5. 缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。 6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 7.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 8. 最后重新设计引物，加强引物的专一性。 |
10楼2013-08-21 23:38:08
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楼主的PCR是出现了出现片状拖带或涂抹带 2013年8月21日总结 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。 其对策有： 减少酶量（一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点，分梯度上下调一调，其他酶也差不多如此浓度，可以参考说明书）；加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。 改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。或者加强Taq DNA聚合酶的专一性。 酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起没浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。 在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以Taq DNA聚合酶。 适当减少dNTP的浓度；减少减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2+浓 度通行偶联进行，但是不必按同样的比例。 适当降低Mg2+浓 度，以每次0.5mol/L递减不要低于1.0mol/L。 4.保证DNA模板的质量，要用电泳检测一下分子量和纯度，质量不好则要重新提取和纯化DNA模板；适当增加DNA模板量，减少循环次数。 5. 缩短退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度提高1-3度；如果出现任何扩增带，则把在引物的Tm少5-10度的范围内把复性温度降低1-3度。4.采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。 6.使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 7.使用热启动模式。可以购买商用的PCR热启动酶，也可以用石蜡隔离模式。 |
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